Vật liệu nghiên cứu

Cây phong lan Đai châu in vitro có rễ được nuôi cấy trên môi trường MS 16 có bổ sung 30 g/L đường sucrose, 2 g/L than hoạt tính, 6 g/L agar (hãng sản xuất Qualigens, Mumbai, India). Mười bình cây (5 cây/bình) được đặt trong phòng nuôi cây với điều kiện nhiệt độ 25°C/22°C (ngày/đêm), chu kì 12 h sáng/12 h tối, chiếu sáng với đèn huỳnh quang (hãng Rạng Đông, Việt Nam, cường độ ánh sáng khoảng 1920–1990 lux). Cây có 2-3 lá được sử dụng cho quá trình luyện ex vitro. Bình chứa cây được cho tiếp xúc với ánh sáng tự nhiên 7 ngày bằng cách đặt trong nhà lưới, sau đó agar được loại bỏ, ngâm cây 5 phút trong dung dịch KMnO 0,1%, đặt trên bề mặt thoáng (có khay chứa nước ở dưới) trong thời gian 7 ngày kế tiếp, phun sương hai lần/ngày, sau đó cây được trồng trong chậu nhựa (đường kính 10 cm) có giá thể là hỗn hợp rêu và than sinh học (tỷ lệ 1:1), đặt trong nhà lưới tại Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Hùng Vương, thời gian nghiên cứu từ tháng 3/2016 đến tháng 9/2016. Các mẫu lá được thu vào các thời điểm: cây in vitro trước khi chuyển ra tiếp xúc với ánh sáng tự nhiên (ngày 0), cây in vitro đã tiếp xúc với ánh sáng tự nhiên 7 ngày (ngày 7), cây ex vitro được cho ra khỏi bình và đặt trên bề mặt thoáng 7 ngày (ngày 14), cây được trồng trên giá thể sau 28, 84 và 140 ngày tính từ ngày 0 (ngày 28, ngày 84 và ngày 140).

Phương pháp nghiên cứu

Ba lá của ba cây khác nhau (một lá/cây) được thu ngẫu nhiên để thực hiện các phân tích sinh lí, hóa sinh. Cây lan tươi được cân bằng cân kĩ thuật (Pioneer TM, Ohaus Corp., Mỹ), sau đó sấy khô đến khối lượng không đổi ở 80C, cân khối lượng khô. Hàm lượng nước, hàm lượng chất khô được tính trên cơ sở khối lượng tươi và khối lượng khô của mẫu nghiên cứu 17. Cường độ thoát hơi nước được xác định bằng phương pháp cân nhanh 17. Hàm lượng proline được xác định theo phương pháp quang học theo Bates và cs (1973) 18. 0,2 g lá tươi mỗi mẫu được nghiền với 5 mL sulfosalicylic acid 3%, li tâm tốc độ 10000 vòng/phút ở 4C trong 20 phút, 2 mL dịch nổi sau li tâm được cho phản ứng với 2 mL ninhydrin và 2 mL acid acetic, ủ trong nước nóng 100C trong 60 phút sau đó ủ trong nước đá 5 phút. Bổ sung vào ống nghiệm phản ứng 4 mL toluen, lắc đều, lấy phần dịch nổi màu hồng và đo giá trị mật độ quang (OD) ở bước sóng 520 nm. Hàm lượng proline được xác định dựa vào đường chuẩn 17. Hoạt độ GPX được xác định bằng phương pháp quang phổ với cơ chất phản ứng là guaiacol theo Fielding and Hall (1978) 19. 0,4 g lá tươi mỗi mẫu được nghiền trong 1 mL đệm phosphate 0,1 M pH 7. Li tâm ở tốc độ 10000 vòng/phút ở 4C trong 10 phút. 0,1 mL dịch li tâm được chuyển sang ống phản ứng, bổ sung 3 mL dung dịch đệm phosphate 0,1 M pH 7, 0,05 mL dung dịch guaiacol và 0,03 mL dung dịch HO 12,3 mM, đo giá trị OD ở 430 nm 17. Các chỉ tiêu phân tích ở mỗi thời điểm gồm ba mẫu được thu ngẫu nhiên. Các giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (SD), và sự khác biệt giữa các giá trị trung bình được kiểm định bằng phép kiểm tra Duncan (p=0,05) bằng phần mềm SPSS.

Hàm lượng nước, chất khô

Khi chuyển cây in vitrora khỏi bình nuôi cây trong quá trình luyện cây ex vitro, độ ẩm không khí là một trong những điều kiện sống thay đổi rõ nét nhất, từ thường ở mức gần bão hòa hoặc bão hòa trong môi trường in vitro giảm xuống khoảng 70–80% ở không khí bên ngoài. Khi chuyển cây từ in vitro sang ex vitro, sự giảm hàm lượng nước trong mô cây táo 5 hoặc cây riềng đã được báo cáo 20.

Khi nghiên cứu hàm lượng nước trong cây phong lan Đai châu trong và sau quá trình luyện cây ex vitro, chúng tôi nhận thấy hàm lượng nước cao khi cây còn trong bình nuôi in vitro (ngày 0 và ngày 7 của quá trình luyện ex vitro), đạt trên 92% khối lượng tươi. Tuy nhiên, khi đưa cây ra khỏi bình in vitro, hàm lượng nước giảm xuống còn 90,36% khối lượng tươi (ngày 14). Hàm lượng nước trong cây Đai châu vẫn thấp ở ngày 28 nhưng sau đó tăng lên bằng mức hàm lượng nước trong cây in vitro ở các cây 84 và 140 ngày tuổi, lần lượt bằng 92,52% và 92,34% sinh khối tươi (Figure 1).

Hàm lượng chất khô trong cây lan Đai châu thời kì luyện ex vitro và trong vườn ươm biến đổi ngược lại với hàm lượng nước (Figure 2). Cây in vitro có hàm lượng chất khô không cao, lần lượt đạt 7,29% (ngày 0) và 7,74% (ngày 7) khối lượng tươi. Hàm lượng chất khô tăng lên ở thời điểm ngày 14 và ngày 28, bằng 9,63% và 9,83% khối lượng tươi. Tuy nhiên, đến thời điểm ngày 84 và ngày 140, hàm lượng chất khô trong cây lần lượt đạt 7,51% và 7,65%. Sự biến đổi hàm lượng nước và hàm lượng chất khô trong cây lan Đai châu ở thời kì luyện ex vitro có thể do sự thay đổi về độ ẩm của môi trường sống. Trong những thời kì đầu, khi độ ẩm môi trường giảm xuống đột ngột, cây mất nước dẫn tới hàm lượng nước giảm, ngược lại hàm lượng chất khô tăng lên. Một nguyên nhân khác có thể làm hàm lượng nước giảm, hàm lượng chất khô tăng là hoạt động quang hợp của cây mạnh hơn ở cây ex vitro so với cây in vitro như ở khoai tây 21. Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi khẳng định những nghiên cứu khác về hàm lượng nước trong cây táo ở thời kì luyện ex vitro, ở loài này, cây in vitro có hàm lượng nước cao (gần 90%), hàm lượng nước này giảm xuống khoảng 60% vào ngày thứ 5 rồi tăng dần trở lại, đạt tới gần 90% vào ngày thứ 25 và 30 của quá trình luyện cây 5. Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng nước của cây lan Đai châu cho thấy sau thời gian mất nước mạnh ở giai đoạn đầu của quá trình luyện cây ex vitro, hàm lượng nước đã khôi phục ở mức cao sau 84 ngày thể hiện trạng thái nước bình thường của cây trong nhà lưới (lan Đai châu là cây thuộc nhóm thực vật mọng nước CAM).

Cường độ thoát hơi nước

Thoát hơi nước là quá trình sinh lý giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì trạng thái nước, nhiệt độ lá, sự hấp thu dinh dưỡng khoáng đồng thời giữ vai trò quan trọng đối với hoạt động quang hợp và hô hấp ở thực vật 22.

Cường độ thoát hơi nước mạnh nhất ở lá của cây phong lan Đai châu in vitro (ngày 0), đạt mức 0,146 g/dm/h. Ở ngày 7, cường độ thoát hơi nước giảm xuống mức 0,097 g/dm/h. Cường độ thoát hơi nước của lá giảm xuống mức thấp nhất ở thời điểm ngày 14, có thể, ở thời điểm này, cây đã mất nước nhiều nhất, hàm lượng nước trong cây còn thấp nhất nên lượng nước đi ra theo con đường thoát hơi nước giảm thấp. Ở các thời điểm ngày 28, ngày 84 và ngày 140, cường độ thoát hơi nước của lá cây lan Đai châu đều thấp hơn so với ở ngày 0 (Figure 3). Một số nghiên cứu cũng đã chỉ ra cây in vitro có cường độ thoát hơi nước qua lá lớn, nguyên nhân có thể do độ mở khí khổng lớn hoặc do cây in vitro có ít sáp hoặc ít lông trên bề mặt lá trong khi mật độ khí khổng lớn. Khi cây được đưa ra ngoài tự nhiên, cường độ thoát hơi nước giảm do khí khổng đóng bớt lại hoặc có thể do tổ chức sáp hoặc lông trên bề mặt lá phát triển hơn, mật độ khí khổng giảm, sự tiêu phí nước qua quá trình thoát hơi nước đã ổn định, giúp cây thích nghi với môi trường tự nhiên 21, 23, 24, 25, 26, 27.

Hàm lượng proline

Proline thuộc nhóm acid amine tự do, ưa nước, có khả năng hòa tan mạnh trong nước và tạo áp suất thẩm thấu cho tế bào. Acid amine này được tích lũy trong tế bào thực vật trong điều kiện sinh lí bình thường và khi bị stress. Từ lâu, proline được chứng minh có rất nhiều vai trò trong sự phát triển cũng như tính chống chịu của thực vật, đặc biệt khi môi trường sống thay đổi 28, 29.

Kết quả phân tích hàm lượng proline trong mô lá của cây phong lan Đai châu ở các giai đoạn luyện cây (Figure 4) cho thấy rằng hàm lượng proline trong lá đạt 73,74 µg/g ở 0 ngày nhưng tăng lên132,36 µg/g ở ngày 7. Hàm lượng của acid amine này trong lá tiếp tục tăng cao ở thời điểm ngày 14 (150,83 µg/g lá tươi). Ở các thời điểm sau, hàm lượng proline giảm xuống, bằng (ngày 28) hoặc thấp hơn (ngày 84 và ngày 140) so với ở thời điểm ban đầu. Có thể khi chuyển cây ra khỏi phòng nuôi cây, ánh sáng và sự mất nước đã kích hoạt cơ chế tự vệ bằng cách tăng sinh tổng hợp proline giống như ở nhiều loài thực vật đã biết khác khi bị đặt trong điều kiện stress 28, 29. Rất gần đây, trong nghiên cứu về quá trình luyện cây Pitcairnia encholirioides (họ Dứa, Bromeliaceae) in vitro của Resende et al. (2016), hàm lượng proline trong lá cây ex vitro (ngày 180) cao hơn so với cây in vitro (ngày 150 trong ống nghiệm không đóng nắp) chứa môi trường dinh dưỡng nhân tạo có bổ sung GA3. Tuy nhiên, ở loài này, trong điều kiện ống nghiệm được đóng nắp, hàm lượng proline hầu như không thay đổi giữa cây ex vitro so với cây in vitro. Cũng trong cùng nghiên cứu, nếu môi trường dinh dưỡng nhân tạo có bổ sung NAA thì hàm lượng proline trong lá cây in vitro lại cao hơn so với trong lá cây ex vitro13. Hàm lượng proline (amino acid được tổng hợp trong điều kiện cây bị tác động của stress) giảm xuống ở cuối giai đoạn luyện cây gợi ý rằng cây đã không còn chịu tác động của stress mất nước. Kết quả nghiên cứu này cũng có sự liên hệ với hàm lượng nước cao trong mô lá cây lan Đai châu và sự thoát hơi nước đã ổn định ở cây đã thích nghi với môi trường vào cuối giai đoạn luyện cây.

Hoạt độ guaiacol peroxidase (GPX)

Ở thực vật, các POX liên quan đến rất nhiều các quá trình sinh lý như sự phát triển vách tế bào, chữa lành vết thương, các cơ chế chống tác nhân gây bệnh và loại bỏ HO hình thành trong dịch bào cũng như lục lạp, chống độc tính của kim loại nặng cũng như các gốc oxi tự do hình thành từ các stress oxi hóa hay trao đổi chất tế bào 30. Hoạt độ POX thường tăng lên khi cây chịu tác động của các stress sinh học và phi sinh học 31.

Hoạt độ GPX của mô lá cây phong lan Đai châu đã được phân tích trong quá trình luyện cây và ở cây non trong vườn ươm (Figure 5). So với cây ở ngày 0, cây lan Đai châu ở các thời điểm nghiên cứu sau của quá trình luyện cây ex vitro hay trong nhà lưới đều có hoạt độ GPX cao hơn. Hoạt độ GPX tăng mạnh ở ngày 7 (bằng 2,23 lần so với ở ngày 0) và tăng cao nhất ở ngày 14 (bằng 2,77 lần so với ở ngày 0) khi cây mất nhiều nước nhất. Sau đó hoạt độ GPX giảm xuống ở ngày 28 (bằng 1,37 lần so với ở ngày 0) và lại tăng lên ở các ngày 84 và 140 (lần lượt bằng 1,74 và 2,11 lần so với ở ngày 0).

Biến động hoạt độ GPX trong cây lan Đai châu ở thời kì đầu luyện ex vitro trong nghiên cứu này có điểm tương đồng với biến động hoạt độ GPX ở cây cỏ ngọt, theo đó, hoạt độ GPX ở cây cỏ ngọt ở các ngày 2, 7, 14 của quá trình luyện ex vitro tăng cao hơn hai lần so với cây in tro, sau đó giảm dần ở giai đoạn ngày 21 (bằng 1,2 lần so với ở cây in vitro) và ngày 28 (bằng với ở cây in vitro)9. Sự biến động hoạt độ GPX của cây lan Đai châu trong nghiên cứu này cũng có thể so sánh với sự biến động ascorbate peroxidase (APX) ở cây Đầu đài Ấn Độ 12, hoạt độ enzyme này của cây in vitro thấp hơn so với ở cây ex vitro trong 28 ngày luyện cây. Hai enzyme này đã được chứng minh cùng có hoạt độ tăng lên khi cây gặp điều kiện bất lợi 31. Sự tăng trở lại hoạt độ GPX ở các thời điểm ngày 84 và 140 trong nhà lưới có thể liên quan đến sự sinh trưởng của cây lan Đai châu đã thích nghi với môi trường tự nhiên, vì GPX đã được chứng minh có hoạt độ cao liên quan đến sự làm cứng thành tế bào, một bộ phận của quá trình biệt hóa ở thực vật 9.

Nhìn chung, kết quả phân tích hàm lượng proline, hoạt độ enzyme GPX có sự liên quan đến hàm lượng nước, hàm lượng chất khô cũng như cường độ thoát hơi nước trong nghiên cứu này. Ở giai đoạn in vitro, cây có hàm lượng nước cũng như cường độ thoát hơi nước cao hơn so với cây luyện ex vitro, ngược lại, hàm lượng proline và hoạt độ GPX thấp hơn. Trong các thời điểm ngày 7, 14, 28 của quá trình luyện, khi cây được đưa ra khỏi bình in vitro, đã có hiện tượng stress mất nước diễn ra ở các mức độ khác nhau, dẫn tới kích hoạt các phản ứng hoạt hóa enzyme chống oxi hóa guaiaciol peroxidase cũng như sinh tổng hợp chất bảo vệ thẩm thấu proline, dẫn tới cường độ thoát hơi nước giảm xuống, tích lũy chất khô. Đã có nghiên cứu chỉ ra khi sử dụng proline ngoại sinh đã làm tăng sự tích lũy sinh khối và kiểm soát sự mất nước tốt hơn ở cây lan Cattleya walkerianain vitro32. Ở các thời điểm 84 và 140 ngày trong nhà lưới, hàm lượng nước trong cây được khôi phục, tác động của stress mất nước giảm xuống, nên hoạt độ GPX và hàm lượng proline đều giảm xuống. Các dấu hiệu này đều góp phần chứng minh quá trình luyện cây ex vitro đã thành công, cây đã không còn bị stress khi được đưa ra khỏi môi trường in vitro.