Đối tượng nghiên cứu

Củ, thân, và lá tươi của cây Ngải bún được lấy tại tỉnh An Giang vào tháng 01 năm 2017 và được định danh bởi TS. Đặng Lê Anh Tuấn, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM. Củ Ngải bún (10 kg) được thu hái phơi khô và cắt nhỏ.

Hóa chất và thiết bị

Hợp chất tinh khiết pinostrobin được cô lập từ củ Ngải bún và xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại FT-IR, NMR và UV. Hệ thống HPLC-DAD Agilent 1260, cột sắc ký pha đảo Eclipse Plus XDB-C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm), các loại dung môi tinh khiết phân tích methanol, ethanol, acetonitrile của hãng Scharlau, phosphoric acid (Merck –HPLC), ethanol 96% công nghiệp (Việt Nam).

Thiết lập chất chuẩn đối chiếu

Do không có chất chuẩn đối chiếu pinostrobin trong quá trình nghiên cứu, nên việc định lượng hợp chất pinostrobin được thực hiện bằng phương pháp HPLC-DAD quy về 100% diện tích peak trên sắc ký đồ. Điều kiện định lượng pinostrobin được tối ưu trên thống HPLC-DAD Agilent 1260 như sau cột Eclipse Plus XDB-C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm), tốc độ dòng 1,0 mL/phút, nhiệt độ cột 35°C, thể tích tiêm 10 μL, bước sóng phát hiện 290 nm, hệ pha động tối ưu ACN-MeOH–HPO 0,05% (40:25:35). Mẫu thử pinostrobin 1000 ppm pha trong dung môi ethanol và được qua màng lọc PTFE 0,45 µm.

Quá trình thiết lập chất chuẩn pinostrobin được thực hiện theo các bước: đóng gói và đánh giá độ đồng nhất của các lọ sau đóng gói, đánh giá kết quả định lượng liên phòng và xác định giá trị định lượng công bố. Mỗi lọ được định lượng 2 lần và lấy kết quả trung bình bằng phương pháp HPLC-DAD với kết quả được quy về 100% diện tích peak. Thực hiện kiểm tra Dixon và phân tích phương sai một yếu tố theo ANOVA để đánh giá kết quả thu được.

Việc đánh giá kết quả định lượng liên phòng được thực hiện tại 2 phòng thí nghiệm: phòng thí nghiệm Nghiên cứu ung thư – hướng Hóa dược (PTN1) và Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm (PTN2) của Trường Đại học khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM. Thực hiện kiểm tra Dixon và xác định giá trị ấn định của pinostrobin theo hướng dẫn TCVN 9596:2013 (ISO 13528:2003) để ứng dụng làm chất chuẩn đối chiếu trong quy trình định lượng ở nghiên cứu tiếp theo.

Hệ thống HPLC-DAD và điều kiện sắc ký

Quy trình định lượng HPLC của pinostrobin được tối ưu trên thống HPLC-DAD Agilent 1260 như sau: cột Eclipse Plus XDB-C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm), tốc độ dòng 1 mL/phút, nhiệt độ cột 35°C, thể tích tiêm 10 μL, bước sóng phát hiện 290 nm, hệ pha động tối ưu ACN-MeOH–HPO 0,05% (40:25:35), thời gian phân tích 25 phút. Các dung môi và hóa chất đều đạt điều kiện tinh khiết phân tích dùng cho HPLC.

Khảo sát quy trình điều chế cao chiết củ Ngải bún với tỉ lệ ethanol: nước khác nhau

Dựa trên các kết quả khảo sát về thể tích dung môi, số lần ly trích và thời gian ly trích nhận thấy: với 20 g mẫu củ Ngải bún khô cần sử dụng 150 mL dung môi đun hoàn lưu trong 30 phút, số lần thực hiện 5–6 lần giúp đạt hàm lượng pinostrobin cao nhất.

Cân chính xác khoảng 20 g mẫu khô từ củ Ngải bún cho vào các bình cầu 250 mL, thực hiện 6 mẫu với 150 mL dung môi có các tỉ lệ dung môi cồn ethanol khác nhau cho vào erlen: 10:0; 9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 0:10 và sau đó đun hoàn lưu trong 3 giờ. Lọc lấy dung dịch trích, tiếp tục thêm dung môi vào đun hoàn lưu 5–6 lần nữa đến dịch trích hết màu vàng nhạt, lọc, dịch trích được cô quay và cân khối lượng cao thu được (m). Cân tổng khối lượng cao thu được và tính toán hiệu suất chiết.

Chuẩn bị mẫu phân tích

Chất chuẩn đối chiếu pinostrobin: sử dụng pinostrobin đã được thiết lập làm chất chuẩn đối chiếu. Cân chính xác 10 mg pinostrobin, hòa tan trong 10 mL ethanol. Các dung dịch pinostrobin có nồng độ thấp hơn được pha loãng từ dung dịch trên bằng ethanol.

Mẫu thử: Cân lượng mẫu cao trong khoảng từ 0,01–0,05 g, hòa tan và định mức thành 10 mL bằng dung môi ethanol 100%. Lọc dung dịch này qua màng lọc PTFE 0,45 µm. Dùng micropipette hút 100 µL dịch lọc và 900 µL ethanol 100% cho vào vial 1,5 mL và chuyển vial vào hệ thống tiêm mẫu tự động của máy HPLC. Phân tích HPLC và tính toán hàm lượng pinostrobin có trong mẫu.

Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng pinostrobin và ứng dụng phân tích các mẫu Ngải bún

Khảo sát điều kiện sắc ký

Khảo sát bước sóng phát hiện bằng cách triển khai mẫu chuẩn đối chiếu pinostrobin có nồng độ 100 ppm trên máy HPLC với tốc độ dòng 1 mL/phút, dải bước sóng phát hiện từ 200–900 nm. Dựa vào kết quả đo phổ của đầu dò DAD tìm bước sóng hấp thu cao nhất của pinostrobin, từ đó lựa chọn bước sóng phát hiện. Khảo sát hệ dung môi dùng cho HPLC: khảo sát trên mẫu cao ethanol của củ Ngải bún đã chuẩn bị như trên. Khảo sát 2 hệ dung môi khác nhau ACN-MeOH-HO (30:30:40) và ACN-MeOH–HPO 0.05% (40:25:35). Sắc kí đồ phải cho thấy peak của chất pinostrobin tách rời tạp chất, peak nhọn và đối xứng với độ phân giải lớn hơn 1,5.

Tính tương thích hệ thống

Phân tích HPLC lặp lại 6 lần dung dịch chất đối chiếu pinostrobin 100 ppm ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích mũi, hệ số bất đối xứng, số đĩa lý thuyết, độ phân giải. Tính độ lệch chuẩn tương đối (RSD).

Tính chọn lọc (độ đặc hiệu)

Tiến hành phân tích HPLC mẫu trắng (dung môi ethanol), mẫu chuẩn 100 ppm, mẫu cao ethanol củ Ngải bún và mẫu thử thêm chuẩn. Mẫu trắng phải không có tín hiệu của pinostrobin. Mẫu chuẩn, mẫu cao ethanol và mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu của pinostrobin cùng thời gian lưu và cường độ mẫu thêm chuẩn phải tăng lên tương ứng theo hàm lượng chất chuẩn thêm vào.

Khảo sát tính tuyến tính

Tiến hành phân tích các dãy dung dịch chuẩn có nồng độ pinostrobin từ 0,5 ppm đến 1000 ppm. Chọn mô hình hồi quy tuyến tính bậc nhất để mô tả quan hệ giữa nồng độ pinostrobin và diện tích peak, tính giá trị của hệ số tương quan R.

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Dựa vào điểm thấp nhất của đường chuẩn, thực hiện việc xác định LOD và LOQ của phương pháp. Dự đoán LOD bằng cách so sánh giá trị tung độ gốc đường tuyến tính và diện tích peak của nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn (0,5 hoặc 1.0 ppm) và dự đoán nồng độ tín hiệu bị nhiễu đáng kể bởi đường nền. Thực hiện: làm trên mẫu thử (chuẩn đối chiếu) 10 lần song song. Giới hạn phát hiện của phương pháp là LOD = 3×SD và giới hạn định lượng của phương pháp là LOQ = 10×SD.

Độ lặp lại

Thực hiện phân tích 6 mẫu chuẩn pinostrobin 100 ppm và 6 mẫu cao ethanol (khối lượng mẫu khoảng 0,05 g) bằng phương pháp HPLC trong cùng một ngày. Tính hàm lượng trung bình của pinostrobin và RSD với giá trị cho phép RSD ≤ 5%.

Độ đúng

Thực hiện thêm chuẩn vào nền mẫu cao củ Ngải bún đã xử lý ở ba mức nồng độ khác nhau, 80%, 100%, 120% so với hàm lượng trong mẫu thử, mỗi mức lặp lại 3 lần. Tiến hành phân tích HPLC và tính phần trăm hàm lượng chất chuẩn tìm lại được so với lượng chuẩn ban đầu đã thêm vào.

Ứng dụng phân tích các mẫu thử

Sau khi đã thẩm định phương pháp với các điều kiện tốt nhất, tiến hành định lượng các mẫu cao trích từ củ Ngải bún với các tỉ lệ dung môi đã khảo sát, so sánh hàm lượng pinostrobin thu được từ các tỉ lệ dung môi khác nhau.

Thiết lập chất chuẩn đối chiếu

Đóng gói và đánh giá độ đồng nhất giữa các lọ

Thực hiện đóng gói: 500 mg pinostrobin được đóng gói thành 50 lọ với khối lượng 10 mg/lọ. Các lọ được sử dụng là vial thủy tinh 1,5 mL tối màu có chứa khí nitrogen 95%, bảo quản ở nhiệt độ 2–8C, tránh ánh sáng trực tiếp. Số lọ được đánh giá độ đồng nhất được lựa chọn ngẫu nhiên với số lượng theo công thức = 8 lọ (với N là 50 lọ). Do F < F (Table 1) nên không có sự khác biệt thống kê giữa các kết quả đo được, vậy các lọ chất chuẩn đối chiếu pinostrobin đạt yêu cầu về độ đồng nhất hàm lượng sau khi đóng gói.

Kết quả định lượng liên phòng được thực hiện tại 2 phòng thí nghiệm cho thấy hàm lượng pinostrobin trong các lọ đều trên 95% và các giá trị RSD nhỏ hơn 2% (Table 2).

Từ kết quả thu được tiến hành kiểm tra z-score cho thấy các giá trị ׀z׀ < 2, không có giá trị bất thường trong 20 lọ sau khi phân tích. Tính giá trị ấn định của pinostrobin trong 20 lọ theo hướng dẫn TCVN 9596:2013 (ISO 13528:2003) về xác định giá trị ấn định trong so sánh liên phòng thí nghiệm. Giá trị ấn định từ 20 kết quả thu được cho thấy hàm lượng trung bình của pinostrobin là 99,26% với RSD là 0,087% và độ không đảm bảo đo là 0,174% (Table 3).

Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng pinostrobin

Khảo sát điều kiện sắc ký

Khảo sát bước sóng phát hiện bằng cách triển khai mẫu chuẩn đối chiếu pinostrobin có nồng độ 100 ppm trên máy HPLC với tốc độ dòng 1 mL/phút, bước sóng phát hiện từ 200–800 nm. Dựa vào kết quả đo phổ của đầu dò DAD cho thấy bước sóng hấp thu cực đại của pinostrobin là 292 nm và được chọn làm bước sóng phát hiện (Figure 1).

Hợp chất pinostrobin có cấu trúc kém phân cực do đó sử dụng phương pháp RP-HPLC để phân tích các hợp chất này. Vì hợp chất pinostrobin làm chất đối chiếu có tính acid nên dung dịch đệm acid vô cơ loãng trong nước được sử dụng là pha động. Tham khảo tài liệu về sử dụng dung môi pha động để tách pinostrobin, sau đó thay đổi thành phần để thu được hệ pha động tối ưu, các dung môi sử dụng trong pha động được chọn gồm ACN, MeOH, HO và HPO [12-13]. Khảo sát 2 hệ dung môi khác nhau ACN-MeOH-HO (30:30:40) và ACN-MeOH–HPO 0,05% (40:25:35).

Kết quả cho thấy sắc ký đồ thu được từ hệ pha động ACN-MeOH–HPO 0,05% (40:25:35) cho peak sắc ký của pinostrobin nhọn và đối xứng. Do đó hệ pha động ACN-MeOH–HPO 0,05% (40:25:35) được lựa chọn để xây dựng quy trình định lượng pinostrobin (Figure 2 và Figure 3).

Tính tương thích hệ thống

Kết quả phân tích HPLC lặp lại 6 lần của dung dịch chất đối chiếu pinostrobin 100 ppm, ghi lại các giá trị trung bình của các thông số và RSD tương ứng: thời gian lưu 12,0 phút với RSD 0,93%, diện tích peak 4548,3 với RSD 0,88%, hệ số bất đối xứng (A) 1,19 với RSD 0,55%, số đĩa lý thuyết (N) 14555, độ phân giải (R) 14,59. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các đại lượng đều nhỏ hơn 2%.

Tính chọn lọc (độ đặc hiệu)

Tiến hành phân tích HPLC mẫu blank (dung môi ethanol), mẫu chuẩn 100 ppm, mẫu cao ethanol củ Ngải bún và mẫu thử thêm chuẩn (Figure 4). Mẫu trắng không có tín hiệu của pinostrobin. Sắc ký đồ mẫu cao ethanol củ Ngải bún xuất hiện peak pinostrobin ở thời gian lưu 12 phút tương ứng với mẫu chuẩn. Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn có tín hiệu của pinostrobin cùng thời gian lưu và diện tích peak tăng lên rõ rệt.

Khảo sát tính tuyến tính

Trong khoảng nồng độ khảo sát của dung dịch chuẩn pinostrobin từ 0,5 ppm đến 1000 ppm. Sử dụng TCVN 6661-1:2000 kết hợp với phần mềm excel – phân tích phương sai một chiều ANOVA để đánh giá sự phù hợp của mô hình hồi quy tuyến tính, cũng như khoảng tuyến tính và khoảng làm việc của phương pháp. Cho thấy khoảng tuyến tính 0,5 - 500 ppm là phù hợp. Kết quả đường tuyến tính như sau: y = 41,86 C + 79,18 với R = 0,999.

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Dựa vào kết quả đường tuyến tính của khoảng làm việc, có thể thấy rằng giá trị tung độ gốc đường tuyến tính là 79,18 lớn hơn tín hiệu tại điểm thấp nhất của đường tuyến tính 0,5 ppm (diện tích peak là 30.3). Nên có thể dự đoán rằng ở nồng độ 0,5 ppm tín hiệu bị nhiễu đáng kể bởi đường nền. Dự đoán giới hạn phát hiện tín hiệu (LOD) của phương pháp là 0,5 ppm (điểm thấp nhất của đường chuẩn). Thực hiện pha 10 dung dịch có nồng độ 2 ppm (gấp 4 LOD ước lượng) đo và thu được kết quả giá trị R ở trong khoảng 4 - 10 nên nồng độ lựa chọn thử nghiệm 2 ppm là phù hợp. Giới hạn phát hiện của phương pháp là LOD = 3×SD = 0,29 ppm. Giới hạn định lượng của phương pháp là LOQ = 10×SD = 0,96 ppm.

Độ lặp lại

Thực hiện phân tích 6 mẫu chuẩn pinostrobin 100 ppm và 6 mẫu cao ethanol (khối lượng mẫu khoảng 0,05 g) bằng phương pháp HPLC trong cùng một ngày. Kết quả của cho thấy thời gian lưu của peak pinostrobin trong chuẩn và mẫu cao ethanol là giống nhau khoảng 12,0 phút với RSD 1,8%, diện tích peak của mẫu cao ethanol là 2654,2 với RSD là 1,7% và diện tích peak của chuẩn là 4285,5 với RSD là 1,3%. Điều này chứng tỏ quy trình đạt yêu cầu về độ lặp lại.

Độ đúng

Thực hiện thêm chuẩn vào nền mẫu cao củ Ngải bún (có hàm lượng pinostrobin khoảng 140 mg/g mẫu cao) ở ba mức nồng độ khác nhau, 80%, 100%, 120% so với hàm lượng trong mẫu thử, mỗi mức lặp lại 3 lần. Kết quả tỉ lệ phục hồi tương ứng ở mỗi nồng độ thêm chuẩn như trên là 97,46; 97,70 và 97,98 đã chứng tỏ rằng quy trình định lượng pinostrobin trong mẫu khảo sát đạt yêu cầu về độ đúng.

Ứng dụng phân tích các mẫu thử

Sau khi đã thẩm định phương pháp với các điều kiện tốt nhất, tiến hành định lượng các mẫu cao từ củ Ngải bún để kiểm tra định tính và định lượng pinostrobin. Sau khi mẫu được phân tích bằng phương pháp HPLC tiến hành so sánh thời gian lưu và diện tích peak của mẫu thử và mẫu chuẩn, áp dụng quy trình hồi quy bậc nhất để tính hàm lượng pinostrobin có trong các mẫu cao chiết. Cân lượng mẫu cao trong khoảng từ 0,0100–0,0500 g, hòa tan và định mức thành 10 mL bằng dung môi ethanol 100%. Lọc dung dịch này qua màng lọc PTFE 0,45 µm. Dùng micropipette hút 100 µL dịch lọc và 900 µL ethanol 100% cho vào vial 1,5 mL và chuyển vial vào hệ thống tiêm mẫu tự động của máy HPLC. Phân tích HPLC và tính toán hàm lượng pinostrobin có trong mẫu.

Quá trình ly trích cao củ Ngải bún bằng phương pháp đun hoàn lưu được thực hiện với thể tích dung môi cho mỗi lần chiết là 150 mL cho thấy cao EtOH:HO (5:5) cho hiệu suất cao nhất là 20,3% (Table 4). Tuy nhiên, tiến hành định lượng pinostrobin trong các mẫu khảo sát thì với dung môi EtOH hàm lượng pinostrobin là cao nhất 22,05%. Vì vậy, dung môi ly trích tốt nhất để chiết pinostrobin trong khảo sát này là EtOH.