Vật liệu

Hóa chất: silymarin (Sigma), trolox (Sigma-Aldrich), ethanol (Trung Quốc), acetic acid (Merck), glutathione (Đài Loan), 5,5’-dithio-bis-nitrobenzoic (Merck), trichloroacetic acid (Merck), hematoxylin (Merck), Eosin Y (BDH, Anh), CCl (Merck), DPPH (Merch), DMSO (Merck) và một số hóa chất khác.

Vật liệu: VTCS được thu tại núi Cấm, tỉnh An Giang vào tháng 06 năm 2018. Mẫu cây được định danh dựa vào các đặc điểm hình thái thực vật trong bộ sách Cây Cỏ Việt Nam dưới sự hỗ trợ của thạc sĩ Phùng Thị Hằng (Bộ môn Sư phạm Sinh học, Khoa Sư phạm, Đại học Cần Thơ). Mẫu được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Thực vật 2, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ.

Đối tượng thí nghiệm là chuột nhắt trắng (Mus musculus var Albino) giống đực khỏe mạnh, trọng lượng từ 30-35 gram do Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp, được nuôi ở phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại Học Cần Thơ ở nhiệt độ phòng và chu kỳ sáng tối 12/12 giờ.

Điều chế cao chiết

VTCS (14200 g) sau khi thu về được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ từ 40–45C. Mẫu sau khi khô được xay nhuyễn thành mẫu bột. Bột nguyên liệu (4000 g) được cho vào trong túi vải và ngâm dầm trong ethanol (10 L). Mẫu được ngâm 3 lần, mỗi lần ngâm khoảng 24 giờ, dịch chiết từ các lần ngâm được gom lại, cô đuổi dung môi 15 thu được 155,2 g cao ethanol VTCS, cao chiết có ẩm độ 4,68±0,05% được xác định dựa vào cân phân tích độ ẩm hồng ngoại FD-610 (Kett, Janpen).

Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa

Phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết được xác định nhờ phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH của Sharma & Bhat 16 có hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm 40 µL DPPH (1000 µg/mL) và 960 µL cao chiết ở những nồng độ khác nhau: 1, 2, 4, 6 8 và 10 µg/mL. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong tối 30C trong thời gian 30 phút. Sau đó, đo độ hấp thụ quang phổ của DPPH bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 517 nm.

Khảo sát hoạt tính bảo vệ gan

Thí nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết được thực hiện theo Kang & Koppula 19 và Phan Kim Định et al. 20 có hiệu chỉnh. Chuột được gây tổn thương gan bằng CCl liều 2,5 mL/kg trọng lượng chuột (CCl pha trong dầu olive theo tỉ lệ 1:4). Chuột khỏe mạnh được chia ngẫu nhiên thành 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 5 con chuột. Các nghiệm thức chuột thí nghiệm được bố trí như sau: chuột bình thường uống nước cất; chuột uống dầu Olive và DMSO 1%; đối chứng bệnh lý (chuột chỉ uống CCl); đối chứng dương (chuột tổn thương gan điều trị bằng silymarin liều 16 mg/kg trọng lượng); chuột tổn thương gan điều trị bằng cao chiết VTCS liều 100 mg/kg, 200 mg/kg hoặc 400 mg/kg trọng lượng. Thời gian thí nghiệm kéo dài 4 tuần, kết thúc thí nghiệm chuột được cân trọng lượng, gây mê giải phẫu lấy máu ở tim để xét nghiệm sinh hóa (alanine transaminase, aspartate transaminase) gan được tách lấy rửa qua dung dịch sinh lý và chia làm hai phần, một phần để phân tích sinh hóa (malondialdehyd, glutathione) và phần còn lại thực hiện tiêu bản mô học.

Thống kê phân tích số liệu

Số liệu được trình bày bằng giá trị trung bình±sai số chuẩn của các giá trị trung bình (SEM). Kết quả được xử lý thống kê theo phương pháp ANOVA bằng phần mềm Minitab 16.0 và Excel. Hoạt tính kháng oxy hóa được so sánh với chất chuẩn trolox dựa trên giá trị EC, nồng độ tại đó chất chuẩn hay cao chiết khử hoặc trung hòa được 50% gốc tự do (EC-Effective Concentration of 50%).

Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết VTCS

Hiệu quả kháng oxy hóa của cao chiết VTCS theo 3 phương pháp là TAC, FRAP và DPPH đã được thực hiện và trình bày trong Figure 1. Hoạt tính kháng oxy hóa tổng được xác định dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0392x + 0,3447 (R²=0,9963). Theo đó, cao chiết VTCS (EC=3,96±0,04 µg/mL) có khả năng khử Mo (VI) thành Mo (V) mạnh hơn trolox (EC=35,02±0,40 µg/mL) là 8,84 lần. Dựa vào phương trình tuyến tính y = 0,0875x + 0,2701 (R² = 0,9995) và kết quả trình bày ở Figure 2 cho thấy, tiềm năng khử (FRAP) của cao chiết VTCS kém hơn trolox chỉ 2,57 lần. Nguyên nhân là do sự hiện diện của các chất kháng oxy hoá trong cao chiết làm giảm dạng oxy hoá sắt (Fe) thành dạng khử (Fe) bằng cách cho một điện tử 24. Không những thế, cao chiết VTCS còn có khả năng trung hòa các gốc tự do DPPH với phương trình hồi quy tuyến tính y = 5,0791x + 2,6406 (R²=0,999) và giá trị EC là 9,33±0,07 µg/mL, kém hơn chất chuẩn trolox 14,35 lần.

Ảnh hưởng của cao chiết VTCS đến trọng lượng chuột

Sự gia tăng trọng lượng cơ thể chuột và tỷ lệ tương đối trọng lượng gan/cơ thể chuột sau 4 tuần thí nghiệm ở các nghiệm thức được thể hiện cụ thể trong Figure 2. Khi so sánh giữa các nghiệm thức đối chứng với nhau, chuột ở nghiệm thức uống nước cất và Olive+DMSO 1%, đạt 6,7±0,67 gram và 5,7±0,49 gram, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Từ đó chứng tỏ, olive và DMSO 1% không ảnh hưởng đến chuột. Trong khi đó, chuột ở nghiệm thức uống CCl có khối lượng cơ thể bị giảm so với khối lượng ban đầu. Ở nghiệm thức này, sau khi cho uống CCl, chuột bị lừ đừ, ít hoạt động, chán ăn, một số con lông ở gần phần đuôi bị ướt, đôi khi bị tiêu chảy trong quá trình thí nghiệm nên trọng lượng chuột không tăng như các nghiệm thức khác. Theo nghiên cứu của Phan Kim Định et al. 25, sự gia tăng trọng lượng nhóm chuột uống CCl ít hơn nhóm chuột bình thường.

Trong khi đó, chuột bị tổn thương gan bởi CCl được điều trị bằng cao chiết VTCS có sự gia tăng trọng lượng cơ thể tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết. Chuột được cho uống cao VTCS có trọng lượng gia tăng khác biệt có ý nghĩa so với nhóm chuột uống nước cất, silymarin lần lượt là 1,1 và 1,97 lần. Trái ngược với sự gia tăng trọng lượng cơ thể, chuột uống CCl có tỷ lệ tương đối trọng lượng gan/cơ thể là 9,28±0,23% cao nhất trong các nghiệm thức được khảo sát. Điều này là do CCl là một loại chất độc gây trương phồng tế bào, cho nên làm cho các tế bào gan phình to lên 26, do đó trọng lượng của gan tăng lên nhanh hơn trọng lượng cơ thể. Cao chiết VTCS được sử dụng ở các liều 100, 200 và 400 mg/kg làm cho tỷ lệ tương đối trọng lượng gan/cơ thể giảm dần theo nồng độ cao chiết. Xét về mặt thống kê, tỷ lệ tương đối trọng lượng gan/cơ thể ở nhóm chuột bình thường tương đương với nhóm chuột sử dụng cao chiết và silymarin. Từ đó, cho thấy hiệu quả bảo vệ gan của cao chiết VTCS trong việc duy trì trọng lượng gan tương đương với nhóm bình thường.

Ảnh hưởng của cao chiết VTCS đến hình thái gan chuột

Khả năng tổn thương gan của CCl và bảo vệ gan của cao chiết VTCS được đánh giá cảm quan qua việc quan sát hình thái gan chuột trong Figure 3. Kết quả cho thấy, chuột uống nước cất (Figure 3A) và chuột uống DMSO 1% (Figure 3B) gan có bề mặt trơn láng, mềm, mịn và có màu đỏ sậm. Trong khi đó, nhóm chuột uống CCl (Figure 3C) gan có kích thước lớn do tế bào gan phình to, bề mặt gan gồ ghề, xơ cứng. Các vùng trên gan có màu sắc không đồng nhất, phần lớn bị tái nhạt và đôi khi trên bề mặt xuất hiện các đốm đen bất thường. Ngoài ra, trên bề mặt gan ở một số vị trí còn xuất hiện dấu hiệu hoại tử. Từ dó cho thấy, chuột được cho uống CCl đã gây tổn thương gan dẫn đến xơ gan và hoại tử. Riêng nhóm chuột cho uống CCl và điều trị bằng silymarin liều 16 mg/kg trọng lượng chuột (Figure 3D), gan chuột có nhiều cải thiện về mặt hình thái. Bề mặt gan chuột điều trị bằng silymarin đã láng mịn hơn, nhưng vẫn chưa phục hồi hoàn toàn như gan chuột bình thường. Tuy nhiên, gan chuột điều trị bằng silymarin đã có sự cải thiện rõ rệt so với nhóm gây bệnh CCl. Cao chiết VTCS được sử dụng cho thấy hoạt động bảo vệ gan hiệu quả. Cụ thể như sau, màu sắc gan ở nồng độ 100 mg/kg (Figure 3E) tuy nhạt màu hơn nhóm bình thường, nhưng bề mặt gan đã giảm sự ghồ ghề. Ở nồng độ 200 (Figure 3F) và 400 mg/kg (Figure 3G), màu sắc gan kể cả độ láng và các đặc điểm hình thái rất giống với nhóm chuột bình thường.

Ảnh hưởng của cao chiết VTCS đến hàm lượng enzyme ALT và AST

Tổn thương gan nói chung sẽ đi kèm với sự gia tăng hàm lượng các enzyme ALT và AST 27. Như thể hiện trong Table 1, hàm lượng enzyme ALT và AST của những con chuột được cho uống CCl có sự gia tăng đáng kể so với nhóm đối chứng bình thường lần lượt là 10,62 và 35,16 lần (p<0,05). Thông thường, ALT và AST được sử dụng để đánh giá chức năng gan, ALT có độ chính xác cao trong việc theo dõi tình trạng tế bào gan và AST là một chỉ số nhạy cảm của các vấn đề về ty thể, đặc biệt là ở các khu vực trung tâm của gan28. Ngoài ra, AST và ALT thường được sử dụng để đánh giá chức năng gan trong tổn thương gan thực nghiệm và lâm sàng 29. Chuột tổn thương gan bằng CCl và được điều trị bằng cao chiết VTCS ở các liều 100, 200, 400 mg/kg và silymarin liều 16 mg/kg làm giảm đáng kể hàm lượng ALT, AST so với nhóm chuột uống CCl (p<0,05).

Bên cạnh đó, hàm lượng enzyme ALT và AST ở các nhóm chuột sử dụng cao chiết VTCS và silymarin khác biệt không có ý nghĩa so với nhóm chuột bình thường (p>0,05). Từ đó, cho thấy, VTCS có thể bảo vệ gan ở chuột do CCl gây ra điều hòa hàm lượng enzyme ALT, AST tương đương chuột bình thường. Hiệu suất bảo vệ gan được đánh giá thông qua phần trăm giảm hàm lượng enzyme ALT và AST được trình bày trong Table 1. Khi sử dụng liều 100 mg/kg trọng lượng chuột, cao chiết VTCS làm giảm hàm lượng ALT và AST đáng kể so với nhóm đối chứng bệnh, hiệu suất giảm ALT là 85,43±3,60% và AST là 98,51±3,22%. Nhóm chuột uống cao chiết VTCS liều 200 mg/kg thì hàm lượng enzyme ALT và AST trong máu giảm nhiều hơn ở liều 100 mg/kg trọng lượng chuột, hiệu suất giảm ALT và AST lần lượt là 92,11±3,00% và 102,69±0,94%, tương đương với nhóm chuột uống slilymarin. Ở nhóm chuột uống cao chiết VTCS liều 400 mg/kg có tác dụng làm giảm hàm lượng enzyme ALT và AST hiệu quả nhất, hiệu suất giảm ALT là 98,81±0,74 và AST là 104,38±1,21, tương đương chuột bình thường và mạnh hơn silymarin.

Ảnh hưởng của cao chiết VTCS đến hàm lượng MDA và GSH

Stress oxy hóa đóng vai trò chính trong tổn thương gan do sản xuất các dẫn xuất gốc tự do của CCl dẫn đến sự phá hủy màng tế bào và giải phóng các enzyme đánh dấu độc tính gan 30. Stress oxy hóa gây ra bởi CCl có thể được theo dõi ở động vật thí nghiệm bằng cách phát hiện các thông số như MDA 31. Sự peroxy hóa lipid đã được đưa ra giả thuyết là nguyên nhân chính gây tổn thương gan do CCl và do đó có thể được sử dụng như một dấu hiệu của tổn thương oxy hóa. Sự gia tăng MDA như là một đặc điểm của tổn thương gan cũng được coi là một dấu hiệu của peroxid hóa lipid 32. Trong nghiên cứu hiện tại, hàm lượng MDA ở gan chuột bị tổn thương bởi CCl tăng cao lên đến 45,76±0,47 nM MDA/g mô cao gấp 5,24 lần so với chuột bình thường (8,74±1,05 nM MDA/g mô). Hàm lượng MDA đã giảm đáng kể khi được điều trị bằng silymarin và cao chiết VTCS (100, 200 và 400 mg/kg). Cụ thể, cao chiết VTCS sử dụng ở liều 100 mg/kg (17,61±2,35 nM MDA/g mô) cho hàm lượng MDA tương đương với silymarin (16,55±1,80 nM MDA/g mô). Trong khi đó, cao chiết sử dụng ở liều 200 mg/kg có hàm lượng MDA là 8,59±1,56 nM MDA/g mô tương đương với nhóm chuột bình thường. Hàm lượng MDA khi sử dụng cao chiết VTCS liều 400 mg/kg giảm chỉ còn 3,12±1,19 nM MDA/g mô thấp chuột bình thường 2,08 lần và chuột uống CCl 14,67 lần. Quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào vẫn xảy ra trong cơ thể bình thường, nên khi bổ sung một chất kháng oxy hóa vào cơ thể bình thường cũng góp phần làm giảm sản phẩm của quá trình oxy hóa. VTCS có chứa acetogenin-A và acetogenin-B33. Những hợp chất acetogenin đã được chứng minh có hoạt động kháng oxy hóa mạnh với khả năng trung hòa gốc tự do DPPH tương đương với ascorbic acid 34. Chính nhờ vào việc sử dụng cao chiết VTCS có chứa những hợp chất sở hữu khả năng kháng oxy hóa đã làm giảm quá trình peroxy hóa lipid ở chuột bình thường và chuột bị tổn thương gan. Nghiên cứu của Phan Kim Định et al. 35 cũng cho thấy chuột sử dụng cao chiết thực vật có hàm lượng MDA ở gan thấp hơn so với nhóm chuột bình thường.

Glutathione dạng khử (reduced glutathione, GSH) là nhóm thiol nội bào phổ biến nhất, với nồng độ nội bào có thể lên đến 10000 nmol. Ở dạng khử, GSH là một chất kháng oxy hoá đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ tế bào khỏi tác hại của gốc tự do, làm giảm chất oxy hóa nội sinh và stress oxy hoá ngoại sinh 36, 37. Gây tổn thương gan bằng CCl làm giảm GSH trong gan và các chất bảo vệ gan hiệu quả sẽ làm phục hồi hàm lượng GSH trong gan 38. Khả năng bảo vệ gan của cao chiết VTCS dựa vào hàm lượng GSH trong mô gan được trình bày trong Figure 4, hàm lượng GSH của nhóm chuột uống CCl (31,74±14,82 nM GSH/g mô) thấp hơn nhóm chuột bình thường (177,16±16,65 nM GSH/g mô) là 5,58 lần. Ở nhóm chuột gây bệnh được điều trị bằng silymarin hàm lượng GSH đã tăng lên đến 769,71±19,13 nM GSH/g mô). Các nhóm chuột gây bệnh được điều trị bằng cao chiết VTCS có hàm lượng GSH tăng từ 101,22±5,06 nM GSH/g mô ở liều 100 mg/kg lên 896,21±22,69 nM GSH/g mô ở nồng độ 400 mg/kg. Như vậy, ở liều 100 mg/kg cao chiết VTCS đã có thể điều hòa lượng GSH tương đương với hàm lượng GSH ở nhóm chuột bình thường. Điều trị bằng cao chiết VTCS ở nồng độ 400 mg/kg làm cho GSH tăng cao hơn chuột được cho uống silymarin liều 16 mg/kg là 1,16 lần.

Ảnh hưởng của cao chiết VTCS đến cấu trúc mô học gan chuột

Nhiễm độc CCl được đặc trưng bởi sự gia tăng tế bào kupffer và mono. Việc kích hoạt các tế bào kupffer bằng các quá trình viêm trung gian CCl thông qua con đường truyền tín hiệu kappa B (NF-kB) với việc sản xuất các cytokine gây viêm có liên quan đến việc điều hòa sự tăng sinh tế bào và apoptosis 39. Cấu trúc vi thể mô gan có những thay đổi lớn do CCl gây ra dẫn đến tăng đại thực bào, tế bào nhân đông, tế bào nhân tan và tế bào mất nhân. Kích thước tế bào to bất thường, không xếp thành dãy tế bào (Figure 5C). Kết quả này có sự tương đồng với nghiên cứu của Phan Kim Định et al. 24. Khi so sánh với nhóm chuột uống nước cất, cấu trúc gan với các tế bào tròn đều xếp khít nhau tạo thành các dãy hướng tĩnh mạch, nhìn rõ được xoang gan (Figure 5A). Tổn thương gan đã giảm khi sử dụng cao chiết VTCS (100, 200, 400 mg/kg) và silymarin 16 mg/kg, số lượng các đại thực bào cũng như những tế bào bất thường giảm đáng kể so với nhóm chuột bị tổn thương bởi CCl. Kết quả mô học chứng minh rằng việc sử dụng VTCS ngăn ngừa đáng kể tổn thương gan do CCl gây ra. Cơ chế hoạt động của các cao chiết thực vật được quy cho các đặc tính kháng oxy hóa làm tăng hàm lượng GSH trong máu, tăng protein tổng số, ức chế peroxid hóa lipid và tăng hoạt tính của các enzyme kháng oxy hóa khác 40. Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cũng chứng minh rằng các cao chiết thực vật sở hữu khả năng kháng oxy hóa làm tăng hàm lượng các enzyme kháng oxy hóa trong các mô 41. Chính vì vậy, mô gan của chuột đã được phục hồi đáng kể khi sử dụng cao chiết VTCS.