Optimization of protein extraction from green algae Chaetomorpha sp. by response surface methodology
- Institute of Tropical Biology, Vietnam Academy of Science and Technology, Viet Nam
- Graduate University of Science and Technology, Viet Nam
- SaiGon Technology University, Viet Nam
Abstract
Green brackish algae Chaetomorpha sp. are easily found in shrimp ponds in Mekong Delta, Vietnam. They can also be co-cultured with shrimps in brackish water shrimp ponds to increase shrimp health and yield. Chaetomorpha sp. algae contain high amount of protein from 10 to 20% w/w db, including water soluble protein and alkaline-soluble protein with over 88% total protein. Dried material were used for protein extraction by using cellulase enzyme (Crestone Conc., Genecor) and NaOH solution. In this research, we optimize the extraction condition of protein from green algae Chaetomorpha sp. by using response surface methodology (RSM). At optimal extraction conditions, dried material was used for protein extraction by using cellulase enzyme (Crestone Conc., Genecor) with the enzyme dosage of 121 UI/g db at 400C during 90 mins. After extraction, the slurry was centrifuged to separate the algae biomass residue to extract the alkaline-soluble protein. The protein extraction yield by using cellulase enzyme was 38.921 mg/g db. After that the, algae biomass residue was extracted by a 1.2% NaOH solution for 78 mins at 500C. The protein extraction yield was 68.651 mg/g db. The total protein extraction yield was 105.755 mg/g db. The extraction yield was increased 10.33% when using the response surface methodology. Concentrated algae protein can be used as a good protein source for food and feed products.
MỞ ĐẦU
Chaetomorpha là một chi bao gồm 81 loài phân bố từ vùng biển đến vùng nước lợ trên toàn thế giới. Tám loài đã được ghi nhận ở Thái Lan, hầu hết trong số đó được phát hiện ở dọc bờ biển, trong khi đó một số xuất hiện ở vùng nước tù đọng, bao gồm các ao nuôi trồng thủy sản, ống dẫn nước, các hồ chứa và đất ngập mặn 1. Rong thường mọc thành những sợi dài, phát triển thành đám, nổi trên mặt nước. Trong quá trình phát triển, rong Chaetomorpha sử dụng nguồn dinh dưỡng dư thừa trong môi trường nước, do có khả năng hấp thụ phosphate và nitrate trong nước 2. Theo kết quả báo cáo của Dự án SenterNovem ITB-Algen rong Chaetomorpha sp. có thể phát triển trong điều kiện độ mặn rộng và có tốc độ tăng trưởng nhanh (5 – 12%/ngày). Rong Chaetomorpha sp. được người dân địa phương gọi là “rong mền” do rong phát triển thành từng đám đan xen vào nhau như những thảm mền trên mặt nước, sợi rong rất dài từ 2 – 4 m. Loài Chaetomorpha sp. có mặt phổ biến trong các ao nuôi tôm nước lợ quảng canh, có hàm lượng carbohydrate cao (44 – 45% w/w chất khô) và protein dao động từ (11 – 23% w/w chất khô) tùy vào thời điểm thu hoạch. Việc nghiên cứu chuyển hóa sinh khối rong nước lợ thành các sản phẩm có giá trị, đặc biệt là các protein và peptide có hoạt tính sinh học là một cách tiếp cận mới mẻ và rất có triển vọng nhằm khai thác một cách hiệu quả nguồn sinh khối bền vững này 3,4 .
Tác nhân chủ yếu được sử dụng để trích ly protein trong rong là dung môi kiềm. Tác giả Barbarino và Lourenço5 đã nghiên cứu quá trình trích ly protein từ 15 loại rong khác nhau sử dụng dung dịch NaOH 0,1N với sự hỗ trợ của quá trình đồng hóa trên rong được lạnh đông cho hiệu suất trích ly tốt nhất. Tuy nhiên, việc trích ly protein bị hạn chế bởi các thành phần polysaccharide trong thành tế bào như alginate, xylan, cellulose. Để cải thiện khả năng hòa tan của protein rong biển, phương án thường được lựa chọn là sử dụng hệ enzyme thủy phân thành tế bào và các polysaccharide bên trong tế bào. Các tác giả Amano 3 và Fleurence 6 cho thấy sử dụng các hỗn hợp enzyme cellulase, hemicellulase và glucanase giúp gia tăng khả năng trích ly protein từ rong lục. Theo Bạch Ngọc Minh 7 thành phần protein trong rong lục Chaetomorpha sp. gồm hai nhóm protein tan trong kiềm và protein tan trong nước lần lượt chiếm tỷ lệ 55,76% và 34,33% so với tổng khối lượng protein.
Phương pháp qui hoạch thực nghiệm ngày càng được sử dụng phổ biến trong bố trí thí nghiệm. Phương pháp này ưu điểm tiết kiệm thời gian và số lượng mẫu thí nghiệm, đồng thời có thể đánh giá mối tương quan giữa các yếu tố thí nghiệm. Trong số những phương pháp qui hoạch thực nghiệm hiện đại, phương pháp bề mặt đáp ứng với sự hỗ trợ của các phần mềm xử lý số liệu đã trở thành một công cụ hữu ích giúp các chuyên gia thực hiện nghiên cứu các quá trình tối ưu hóa đa nhân tố, nhằm tiết kiệm thời gian, chi phí 8.
Mục tiêu của nghiên cứu này để xác định các giá trị tối ưu cho quá trình thu nhận protein từ rong Chaetomorpha sp. nhằm tiết kiệm chi phí và nâng cao hiệu suất trích ly protein.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu
Rong mền Chaetomorpha sp. được thu nhận tại các ao nuôi tôm quảng canh tại huyện Giá Rai, tỉnh Bạc Liêu sau 15– 20 ngày phát triển tùy thuộc vào điều kiện thời tiết. Rong được vận chuyển trong thùng xốp trong ngày về phòng thí nghiệm (tại Viện Sinh học Nhiệt đới).
Enzyme sử dụng là chế phẩm enzyme cellulase của hãng Genecor, Mỹ với tên thương mại là Crestone Conc. Đây là một loại enzyme cellulase mới được Genecor phát triển, có khả năng hoạt động tốt trong vùng pH trung tính từ 6,0 – 7,5, nhiệt độ từ 45 –55C; có hoạt tính 1.100 UI/mL.
Phương pháp thực nghiệm
Dựa trên kết quả các thí nghiệm trích ly protein từ rong lục Chaetomorpha sp. đã được thực hiện bởi Bạch Ngọc Minh và cộng sự 9, chúng tôi tiến hành lựa chọn các yếu tố có ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly hai nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm của rong Chaetomorpha sp. và tiến hành mô hình tối ưu hoá bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.
Trích ly protein tan trong nước bằng enzyme cellulase và nhóm protein tan trong kiềm bằng dung dịch NaOH
Rong nguyên liệu được đem tách protein tan trong nước với enzyme cellulase (tên thương mại Crestone Conc) trong dung dịch đệm potassium phosphate pH7, nồng độ cơ chất 10% w/v, các yếu tố nồng độ enzyme (UI/g cơ chất), thời gian và nhiệt độ trích ly được khảo sát. Sau khi kết thúc quá trình, dung dịch thí nghiệm được ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút và thu phần dịch nổi để xác định hàm lượng protein hòa tan. Phần bã rắn còn lại sau khi tách protein tan trong nước bằng enzyme được tiếp tục sử dụng để tách chiết protein tan trong dung môi NaOH với tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là (1:20), ở nhiệt độ 50 C, với 2 yếu tố nồng độ NaOH (%) và thời gian trích ly được khảo sát. Sau khi tách, ly tâm thu phần dịch nổi để xác định hàm lượng protein hòa tan.
Bố trí thí nghiệm tối ưu hoá trích ly protein bằng enzyme cellulase
Sau khi tiến hành các thí nghiệm đơn yếu tố, đã lựa chọn được ba yếu tố có vai trò quan trọng trong quá trình trích ly protein bằng enzyme để tiến hành thí nghiệm tối ưu hoá. Phương pháp bề mặt đáp ứng được lựa chọn để tối ưu hoá điều kiện trích ly theo mô hình trực giao cấp 2 có tâm xoáy với 3 thí nghiệm tại tâm. Với ba yếu tố độc lập là: nồng độ enzyme (X), nhiệt độ (X) và thời gian (X ). Hàm mục tiêu lựa chọn là hàm lượng protein hoà tan thu được sau quá trình trích ly. Ma trận thí nghiệm được thiết kế bằng phần mềm Modde 5.0.
Thí nghiệm được thực hiện tương tự thí nghiệm trên với hai yếu tố biến đổi là nồng độ dung môi NaOH (X4) và thời gian trích ly (X).
Phương pháp phân tích
Xác định hàm lượng protein hoà tan
Hàm lượng protein hòa tan được xác định theo phương pháp Lowry trên máy đo quang phổ UV-Vis 10.
Xử lý số liệu
Thí nghiệm tối ưu hóa quá trình trích ly được thực hiện theo mô hình tối ưu hóa hai yếu tố trực giao cấp 2 có tâm xoay với 3 thí nghiệm ở tâm, sử dụng phần mềm Modde 5.0 để thiết kế và xử lý số liệu thực nghiệm.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tối ưu hoá quá trình trích ly protein bằng enzyme cellulase
Mô hình bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố: nồng độ enzyme (X), nhiệt độ (X) và thời gian (X) đến hàm lượng protein hòa tan (mg /g) thu được sau quá trình trích ly được trình bày ở Table 1.
Sau khi phân tích dữ liệu bằng phần mềm Modde 5.0, nhận được kết quả trong Table 2 và Figure 1. Phương trình hồi quy mô tả hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích như sau:
Y = 37,024 + 3,452 X + 2,322 X – 3,137 X – 1,417 X
Trong đó : Y, X, X lần lượt là hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích (mg), nồng độ enzyme (UI/g) và thời gian trích ly (phút).
Mô hình quy hoạch thực nghiệm và kết quả của quá trình trích ly khi thay đổi 3 yếu tố nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời gian trích ly
| STT | Biến mã hoá | Biến thực | Hàm mục tiêu | ||||
| X1 | X2 | X3 | Enzyme (UI/g) | Nhiệt độ (0C) | Thời gian (phút) | Hàm lượng protein (mg/g) | |
| 1 | -1 | -1 | -1 | 50 | 40 | 30 | 27,36 |
| 2 | 1 | -1 | -1 | 150 | 40 | 30 | 32,12 |
| 3 | -1 | 1 | -1 | 50 | 60 | 30 | 28,72 |
| 4 | 1 | 1 | -1 | 150 | 60 | 30 | 34,16 |
| 5 | -1 | -1 | 1 | 50 | 40 | 90 | 33,12 |
| 6 | 1 | -1 | 1 | 150 | 40 | 90 | 36,04 |
| 7 | -1 | 1 | 1 | 50 | 60 | 90 | 30,88 |
| 8 | 1 | 1 | 1 | 150 | 60 | 90 | 37,38 |
| 9 | -2 | 0 | 0 | 16 | 50 | 60 | 20,26 |
| 10 | 2 | 0 | 0 | 184 | 50 | 60 | 36,63 |
| 11 | 0 | -2 | 0 | 100 | 33 | 60 | 37,08 |
| 12 | 0 | 2 | 0 | 100 | 67 | 60 | 38,76 |
| 13 | 0 | 0 | -2 | 100 | 50 | 10 | 28,36 |
| 14 | 0 | 0 | 2 | 100 | 50 | 110 | 38,26 |
| 15 | 0 | 0 | 0 | 100 | 50 | 60 | 37,04 |
| 16 | 0 | 0 | 0 | 100 | 50 | 60 | 35,75 |
| 17 | 0 | 0 | 0 | 100 | 50 | 60 | 38,18 |
Như vậy, theo phương trình hồi qui chỉ có hai yếu tố X, X là ảnh hưởng có ý nghĩa đến hàm lượng protein thu được. Các biến số X, X có ảnh hưởng dương tính đến giá trị của Y; trong khi đó các biến số X và X có ảnh hưởng âm tính đến giá trị của Y. Table 2, cho thấy biến có hiệu ứng lớn nhất là X (nồng độ enzyme), tiếp theo đó là giá trị bậc 2 của X. Hệ số biến thiên thực R của mô hình hồi qui là 0,9 31 và giá trị biến thiên ảo Q là 0,509. Giá trị cuả hai hệ số R và Q càng tiến đến 1 thì độ tin cậy của mô hình hồi qui càng cao. Theo Gabrielsson và cộng sự 11 mô hình thí nghiệm đáng tin cậy khi giá trị biến thiên ảo Q phải lớn hơn 0,5 và R ở trong khoảng 0,80 – 0,97; khi các giá trị R và Q càng gần giá trị 1 thì hàm hồi quy càng mô tả tốt và chính xác các kết quả thí nghiệm.
Như vậy, kết quả của thí nghiệm thu được là hoàn toàn phù hợp với những tiêu chí mà tác giả này đã đưa ra khi quy hoạch thực nghiệm sử dụng phần mềm Modde 5.0.
Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hàm lượng protein khi trích ly bằng enzyme
| Hàm lượng protein | Coeff. SC | Std. Err. | P | Conf.int(±) |
| Constant | 37,0237 | 1,15324 | 7,35717e-009 | 2,7270 |
| X1 | 3,45245 | 0,54153 | 0,00037 | 1,2805 |
| X2 | 0,38992 | 0,54153 | 0,49483 | 1,2805 |
| X3 | 2,32180 | 0,54153 | 0,00362 | 1,2805 |
| X1 * X1 | -3,13687 | 0,59597 | 0,00116 | 1,4092 |
| X2 * X2 | 0,21221 | 0,59597 | 0,73226 | 1,4092 |
| X3 * X3 | -1,41726 | 0,59597 | 0,04902 | 1,4092 |
| X1 * X2 | 0,53250 | 0,70758 | 0,47625 | 1,6732 |
| X1 * X3 | -0,09749 | 0,70758 | 0,89428 | 1,6732 |
| X2 * X3 | -0,53750 | 0,70758 | 0,47228 | 1,6732 |
| N = 17 | Q2 = | 0,509 | Cond. no. = | 4,9932 |
| DF = 7 | R2 = | 0,931 | Y-miss = | 0 |
| R2 Adj. = | 0,842 | RSD = | 2,0014 | |
| Conf. lev. = | 0,95 |
Mối quan hệ của nồng độ NaOH và thời gian trích ly đến hàm lượng protein.
Mối quan hệ của nồng độ enzyme và thời gian trích ly đến hàm lượng protein được thể hiện trên Figure 1. Kết quả cho thấy việc sử dụng enzyme góp phần tăng khả năng chiết xuất protein. Kết luận phù hợp với một số nghiên cứu Wang và cộng sự 12, Guan và Yao 13 trên các đối tượng đậu phộng và yến mạch, nồng độ enzyme (cellulase và xylanase) 100UI/g cơ chất cũng được sử dụng khi nghiên cứu trên rong P. palmate14.
Kết quả tối ưu đạt được theo phương trình hồi quy như sau : nồng độ enzyme là 121 UI/g cơ chất, nhiệt độ trích ly là 40 C và thời gian trích ly là 90 phút. Hàm lượng protein dự đoán theo phương trình hồi quy là 38,921 mg/g cơ chất. Kiểm tra thực nghiệm quá trình trích ly protein từ rong với các thông số tối ưu thu được từ phương trình hồi quy, hàm lượng protein hoà tan thu được trong thực nghiệm là 37,651 mg/g cơ chất. Sự khác biệt về hàm lượng protein giữa giá trị được dự đoán theo phương trình hồi quy và giá trị thực nghiệm là 3,27 %. Như vậy, giá trị thực nghiệm thu được là rất gần với giá trị tính toán từ phương trình hồi quy.
Tối ưu hoá quá trình trích ly protein bằng dung môi NaOH
Sử dụng các thông số đã xác định được sau quá trình tối ưu hoá quá trình trích ly bằng enzyme để tiến hành trích ly ở protein ở giai đoạn đầu. Sau khi ly tâm thu dịch trích protein trong nước, phần bã được sử dụng để tiến hành khảo sát quá trình tối ưu hoá ở giai đoạn trích ly bằng dung môi NaOH. Mô hình bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian (X) và nồng độ NaOH (X) đến hàm lượng protein hòa tan (mg /g) thu được sau quá trình trích ly được trình bày ở Table 3 và Table 4.
Mô hình quy hoạch thực nghiệm và kết quả của quá trình trích ly khi thay đổi 2 yếu tố nồng độ NaOH và thời gian trích ly
| STT | Biến mã hoá | Biến thực | Hàm mục tiêu | ||
| X4 | X5 | Thời gian (phút) | Nồng độ NaOH (%) | Hàm lượng protein (mg/g) | |
| 1 | -1 | -1 | 45 | 0,5 | 33,37 |
| 2 | -1 | 1 | 45 | 1,5 | 60,52 |
| 3 | 1 | -1 | 90 | 0,5 | 60,45 |
| 4 | 1 | 1 | 90 | 1,5 | 65,57 |
| 5 | -2 | 0 | 68 | 0,3 | 51,67 |
| 6 | 2 | 0 | 68 | 1,7 | 64,61 |
| 7 | 0 | -2 | 36 | 1,0 | 30,05 |
| 8 | 0 | 2 | 100 | 1,0 | 65,17 |
| 9 | 0 | 0 | 68 | 1,0 | 63,89 |
| 10 | 0 | 0 | 68 | 1,0 | 65,15 |
| 11 | 0 | 0 | 68 | 1,0 | 66,50 |
Sau khi xử lý số liệu, hệ số biến thiên thực R của mô hình hồi qui là 0,957 và giá trị biến thiên ảo Q là 0,702. Phương trình hồi quy mô tả hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích như sau:
Y = 65,180 + 6,321 X + 10,224 X – 5,509 X X – 8,259 X
Trong đó: Y, X, X lần lượt là hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích (mg /g), thời gian trích ly (phút), nồng độ NaOH (%).
Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hàm lượng protein khi trích ly bằng NaOH
| Hàm lượng protein | Coeff. SC | Std. Err. | P | Conf.int(±) |
| Constant | 65,1798 | 2,23868 | 8,95817e-007 | 5,75471 |
| X4 | 6,32068 | 1,37101 | 0,005786 | 3,52429 |
| X5 | 10,2237 | 1,37101 | 0,000684 | 3,52429 |
| X4*X4 | -2,9950 | 1,63203 | 0,125931 | 4,19529 |
| X5*X5 | -8,2595 | 1,63203 | 0,003896 | 4,19529 |
| X4*X5 | -5,5088 | 1,93875 | 0,036184 | 4,98373 |
| N = 11 | Q2 = | 0,702 | Cond. no. = | 3,6208 |
| DF = 5 | R2 = | 0,957 | Y-miss = | 0 |
| R2 Adj. = | 0,914 | RSD = | 3,8775 | |
| Conf. lev. = | 0,95 |
Theo phương trình hồi qui chỉ có hai yếu tố X, X là ảnh hưởng có ý nghĩa đến hàm lượng protein thu được. Các biến số X, X có ảnh hưởng dương tính đến giá trị của Y; trong khi đó các biến số X và X X có ảnh hưởng âm tính đến giá trị của Y. Dựa vào Table 4, biến X (nồng độ NaOH) là biến có hiệu ứng lớn nhất đến hàm lượng protein (Y) ở cả giá trị bậc 1 và giá trị bậc 2. Tiếp đến là ảnh hưởng của biến thời gian trích ly (X) ở giá trị bậc 1, trong khi đó sự tương tác của hai biến độc lập mang lại hiệu ứng ảnh hưởng thấp nhất đến hàm lượng protein thu được. Mối quan hệ của nồng độ NaOH và thời gian trích ly đến hàm lượng protein được thể hiện trên Figure 2. Hệ số biến thiên thực R của mô hình hồi qui là 0,931 và giá trị biến thiên ảo Q là 0,509.
Mối quan hệ của nồng độ NaOH và thời gian trích ly đến hàm lượng protein.
Kết quả tối ưu đạt được theo phương trình hồi quy như sau : nồng độ dung môi NaOH là 1,2% và thời gian trích ly là 72 phút. Hàm lượng protein dự đoán theo phương trình hồi quy là 68,651 mg/g cơ chất. Sử dụng các thông số tối ưu của quá trình tối ưu hoá để bố trí thí nghiệm thực nghiệm. Hàm lượng protein hoà tan thu được trong thực nghiệm là 68,104 mg/g cơ chất. Sự khác biệt về hàm lượng protein giữa giá trị được dự đoán theo phương trình hồi quy và giá trị thực nghiệm là 0,8 %. Như vậy, giá trị thực nghiệm thu được là rất gần với giá trị tính toán từ phương trình hồi quy.
Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu về quá trình trích ly protein từ rong lục Chaetomorpha sp. để làm cơ sở so sánh cho nghiên cứu, nhưng với các nghiên cứu về trích ly protein từ các đối tượng rong khác cho thấy sự phù hợp của phương pháp bề mặt đáp ứng RSM cho việc tối ưu hoá quá trình trích ly và thu nhận protein 15,16,17,18.
KẾT LUẬN
Phương pháp bề mặt đáp ứng RSM được sử dụng để tối ưu hoá quá trình trích ly protein từ sinh khối sinh lục Chaetomorpha sp. Rong khô được sử dụng để trích ly protein qua hai giai đoạn là trích ly nhóm protein tan trong nước có hỗ trợ của enzyme và trích ly nhóm protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH. Hiệu suất thu nhận protein sau hai lần trích ly là 95,847 mg/g cơ chất khi lần lượt tối ưu các thí nghiệm đơn yếu tố. Tối ưu hoá quá trình trích ly protein bằng qui hoạch thực nghiệm cho tổng hiệu suất thu nhận protein là 105,755 mg/g cơ chất. Hiệu quả trích ly khi sử dụng quy hoạch thực nghiệm tăng 10,33%.
Cam kết không xung đột lợi ích nhóm tác giả
Tôi là tác giả chính của bản thảo công bố kết quả nghiên cứu : “Tối ưu hoá quá trình trích ly protein từ sinh khối rong Chaetomorpha sp. bằng phương pháp bề mặt đáp ứng”. Tôi xin cam kết như sau:
-
Tôi và cộng sự đồng tác giả của bản thảo này đã được phép của Đơn vị tài trợ và của Chủ nhiệm đề tài để sử dụng và công bố kết quả nghiên cứu.
-
Tất cả các tác giả có tên trong bài đều đã đọc bản thảo, đã thỏa thuận về thứ tự tác giả và đồng ý gửi bài đăng trên tạp chí STDJNS.
-
Công trình này không có bất kỳ sự xung đột về lợi ích nào giữa các tác giả trong bài và với các tác giả khác.
Đóng góp của từng tác giả cho bài báo
-
Bạch Ngọc Minh: Tác giả chính của bản thảo, là người soạn thảo bài báo, thiết kế nghiên cứu, phân tích diễn giải các dữ kiện, thu thập dữ kiện và thực hiện các phân tích cơ bản và thống kê.
-
Huỳnh Hoàn Mỹ : tham gia vào thiết kế và thực hiện nghiên cứu, phân tích diễn giải các dữ liệu, thu thập dữ kiện và thực hiện các phân tích cơ bản và thống kê.
-
Hoàng Kim Anh: tham gia soạn thảo và chỉnh sửa bản thảo, phân tích dữ kiện, người trực tiếp quản lý công trình nghiên cứu, cố vấn và thiết kế nghiên cứu.
-
Ngô Kế Sương : tham gia chỉnh sửa bản thảo, cố vấn cho quá trình nghiên cứu từ khi công trình vừa bắt đầu.
Đạo đức trong công bố
-
Bản thảo được công bố với sự đồng thuận của các tác giả có tên trong bản thảo. Các số liệu sử dụng trong bản thảo là hoàn toàn trung thực và không có sự sao chép từ các bản thảo khác.
Danh mục từ viết tắt
-
RSM : response surface methodology (phương pháp bề mặt đáp ứng)