Isolate Neoscytalidium dimidiatum fungal pathogens from pytaya (Hylocereus undatus) and research controlling by microorganisms
- Giatuong Company Ltd.
- Van Lang University
Abstract
In recent years, Neoscytalidium dimidiatum has caused severe white spot disease in Pytaya, while no effective controls have been taken. In this study, two strains of N. dimidiatum NdGV and NdBT were obtained by isolation on water agar medium containing streptomycin, morphological tests, in vitro and in vivo pathogenical tests, and molecular biology tests by sequencing the genes ITS1 and ITS4. By using dual culture technique on potato-glucose agar medium, 100% of Trichoderma spp., 75% of Bacillus spp. and 20% of Streptomyces spp. were able to antagonize N. dimidiatum. The mean antagonistic effect with N. dimidiatum of Trichoderma spp. was higher than Bacillus spp. and the lowest was Streptomyces spp. 56.8%, 55.3% and 54.3% respectively. Especially 5 strains Trichoderma sp. 8.3.5, 8.3.7, 8.3.14, 8.3.19, and 8.3.20 had antagonistic effects of over 60%. The application potential of the 5 selected Trichoderma strains to control N. dimidiatum disease was further strengthened when their antagonistic effect was relatively stable on Pitaya juice agar medium while all Bacillus sp. and Streptomyces sp. were lost the ability to antagonize. It was noteworthy that four of the five strains of Trichoderma sp. were highly compatible, suggesting further studies are needed to apply their combined potency in enhancing the control of N. dimidiatum NdBT and NdGV on Pitaya.
MỞ ĐẦU
Cây Thanh long là loại cây ăn quả mà trong những năm gần đây có tiềm năng xuất khẩu và mang lại lợi ích kinh tế khá cao 1. Thanh long là một trong những loại trái cây quan trọng không những ở cấp quốc gia mà lẫn quốc tế 2. Tuy nhiên, trong những năm gần đây dịch hại là nguyên nhân làm giảm năng xuất và chất lượng quả, đặc biệt là bệnh đốm trắng do nấm Neoscytalidium dimidiatum (thuộc họ Botryosphaeriaceae; bộ Botryosphaeriales; lớp nấm túi Ascomycetes) gây ra 3. Loài nấm này có khả năng lây lan nhanh và kháng với nhiều loại thuốc hóa học đặc trị nấm. Do đó, vi sinh vật được hy vọng là hướng tiếp cận tiềm năng để góp phần phòng trừ bệnh hại do nấm N.dimidiatum và nâng cao chất lượng quả Thanh long 4. Gần đây, một số nghiên cứu đã chứng minh nhiều vi sinh vật khác nhau như Bacillus spp. 5, Streptomyces spp. 6 và Trichoderma sp. 4 … có hoạt tính đối kháng với N.dimidiatum. Mặc dù vậy, các nghiên cứu này chỉ dừng lại ở bước phân lập, định danh các vi sinh vật có khả năng đối kháng với N. dimidiatum và đánh giá hiệu quả đối kháng trong điều kiện in vitro. Thêm vào đó, các nghiên cứu chỉ thực hiện trên một số ít các chủng vi sinh vật đã phân lập được và chưa có các nghiên cứu đánh giá so sánh hiệu quả đối kháng giữa các vi sinh vật với nhau. Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá khả năng kiểm soát in vitro và tiềm năng ứng dụng của các chủng nấm bệnh đã phân lập được bằng nhiều chủng Bacillus, Streptomyces và Trichoderma trong kiểm soát nấm N. dimidiatum.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Chủng vi sinh vật
Hai mươi chủng Trichoderma spp., hai mươi chủng Bacillus spp. và hai mươi chủng Streptomyces spp. được cung cấp bởi Chi nhánh công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương. Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy và bảo quản tương ứng trên các môi trường thạch nghiêng nước chiết khoai tây (PGA), cao thịt – peptone và Gause.
Mẫu Thanh long in vitro và in vivo
Các mẫu Thanh long bị bệnh đốm trắng được thu tại các vườn trồng ở Hàm Thuận Nam (Bình Thuận) và Gò Vấp (Tp. Hồ Chí Minh) được dùng để phân lập nấm bệnh N.dimidiatum. Các mẫu đoạn cành Thanh long in vitro (5 – 10 cm) và cây Thanh long in vivo (mang cành non dài 40 – 50 cm) không bị bệnh được dùng để kiểm tra bệnh học tương ứng in vitro và in vivo.
Phương pháp
Phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum
Nấm bệnh N.dimidiatum được phân lập từ các mẫu Thanh long bị bệnh đốm trắng theo phương pháp của Thongkham và Soytong 2, 7. Sau 2 - 3 ngày đặt mẫu bệnh (0,5 - 1 cm) trên môi trường thạch nước (water agar) có bổ sung streptomycin sulfate 50 mM, tách sợi nấm mọc lên trên mẫu và lan ra môi trường để làm thuần. Các chủng nấm thu được được kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường PGA và khuẩn ty dưới kính hiển vi theo Thongkham, Soytong 2, Yi và cộng sự 1. Kiểm tra bệnh học in vitro và in vivo được thực hiện bằng cách dùng que cấy hoặc kim tiêm tạo vết thương và bôi một ít sinh khối của chủng nấm tương ứng trên các đoạn cành Thanh long (đã được khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 5 giây trước khi rửa lại bằng nước vô trùng và để khô) hoặc cành non trên cây trong nhà lưới 8. Triệu chứng bệnh được ghi nhận theo thời gian sau khi gây nhiễm. Đồng thời, các chủng nấm cũng được gởi đi phân tích trình tự của các gen ITS1 và ITS4 9 ở Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM).
Xác định hiệu quả đối kháng của các chủng vi sinh vật với nấm bệnh
Kỹ thuật nuôi cấy kép trên môi trường PGA được ứng dụng để xác định hiệu quả đối kháng in vitro của các chủng vi sinh vật với nấm bệnh. Hiệu quả đối kháng của các chủng Trichoderma được xác định bằng cách cấy điểm theo kiểu đối xứng với nấm bệnh qua tâm đĩa petri và các điểm cấy cách mép đĩa khoảng 1,5 cm 10. Với Streptomyces và Bacillus, cấy sinh khối Bacillus sp. (hoặc Streptomyces) thành 2 vệt dài 3 cm, đối xứng với điểm cấy nấm bệnh ở tâm đĩa petri, vệt cấy cách mép đĩa 1,5 cm11. Đĩa đối chứng là đĩa chỉ cấy nấm bệnh mà không có Trichoderma, Bacillus hay Streptomyces. Các đĩa sau khi cấy được ủ trong tối đến khi nấm bệnh trên đĩa đối chứng phát triển đến mép đĩa.
Cách tính hiệu quả đối kháng của các chủng vi sinh vật với nấm bệnh Ferreira và cộng sự (1991)10:
Trong đó:
H: Hiệu quả ức chế (%);
A: Đường kính nấm bệnh trên đĩa đối chứng (mm);
B: Đường kính nấm bệnh trên đĩa đối kháng (mm).
Đánh giá tiềm năng ứng dụng trên cây Thanh long
Các chủng vi sinh vật có hiệu quả đối kháng cao được đánh giá tiềm năng kiểm soát nấm bệnh N.dimidiatum trên cây Thanh long bằng cách xác định hiệu quả đối kháng in vitro trên môi trường thạch Thanh long (chứa 20 g agar trong 1 lít nước chiết sau khi đun sôi 30 phút 200 g cành Thanh long). Các chủng có khả năng đối kháng trên môi trường thạch Thanh long tiếp tục được xác định khả năng tương thích theo Ilham và cộng sự 10 để đánh giá tiềm năng ứng dụng phối hợp trong kiểm soát N.dimidiatum.
Xử lý số liệu
Số liệu thu được từ kết quả các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS version 20.0 theo phép thử Duncan, p = 0,05 và được trình bày dưới dạng số trung bình của 3 lần lặp lại.
KẾT QUẢ
Phân lập nấm bệnh N. dimidiatum
Từ các mẫu Thanh long bị bệnh đốm trắng thu được từ Hàm Thuận Nam và Gò Vấp (Hình 1a và b) đã phân lập được 2 dòng nấm trên môi trường thạch nước có bổ sung streptomycine sulfate 50 mM (Figure 1c và d). Trong đó, dòng nấm NdBT được phân lập từ mẫu bệnh thu ở Bình Thuận và NdGV từ mẫu bệnh thu được ở Gò Vấp. Các đặc điểm hình thái khuẩn lạc của hai dòng nấm NdBT và NdGV (Figure 1e và f) tương tự với các báo cáo trước đây 1, 2, 7. Dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 40X, hai dòng NdBT và NdGV có cơ quan sinh dưỡng dạng sợi đa bào có vách ngăn và phân nhánh phức tạp (Figure 1g và h). Sợi nấm sinh sản có dạng chuỗi mang bào tử hay còn gọi là bào tử đốt. Các bào tử có hình tròn hoặc bầu dục.
Kết quả phân lập nấm bệnh
Kiểm tra bệnh học trên các đoạn cành Thanh long in vitro cho thấy các mẫu đối chứng không được gây nhiễm với hai dòng nấm NdBT và NdGV vào vết thương đều không xuất hiện các triệu chứng của bệnh đốm trắng và có hiện tượng vết thương lành lại (Figure 2). Đối với các mẫu được gây nhiễm với nấm vào vết thương, vết nhiễm lan rộng, chuyển sang màu xám đen, vùng xung quanh mô có màu vàng (biểu hiện hoại tử) và lan rộng ra các vùng lân cận theo thời gian tương tự như triệu chứng được mô tả bởi Mohd và cộng sự 8.
Triệu chứng bệnh do dòng nấm NdBT (trái) và NdGV (phải) gây ra trên mô Thanh long
Các kết quả thu được cũng tương tự trên cây Thanh long in vivo (Figure 3). Hai dòng nấm NdBT và NdGV có khả năng gây bệnh trở lại trên cành Thanh long in vivo với các triệu chứng giống với mẫu Thanh long in vitro. Ngoài ra, sau 9 ngày gây nhiễm, trên cành Thanh long xuất hiện các đốm trắng tương tự như mẫu được dùng để phân lập ban đầu. Dựa vào nguồn gốc mẫu phân lập, các đặc điểm hình thái và kiểm tra bệnh học đã cho thấy hai dòng nấm thu được là hai chủng thuộc loài N. dimidiatum.
Triệu chứng do nấm NdBT (trên, trái) và NdGV (trên, phải) gây ra trên Thanh long
Kết quả giải trình tự các đoạn gen ITS1 và ITS4 của hai chủng NdBT và NdGV này có độ tương đồng cao so với trình tự các đoạn gen tương ứng của N. dimidiatum đã được công bố trên Ngân hàng dữ liệu gen NCBI. Điều này giúp một lần nữa khẳng định hai chủng nấm bệnh NdBT và NdGV thuộc loài N. dimidiatum và không mất khả năng gây bệnh sau phân lập.
Sàng lọc chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với các chủng nấm bệnh in vitro
Sàng lọc chủng vi sinh có khả năng đối kháng với hai chủng nấm bệnh
Trong số 20 chủng Streptomyces spp. chỉ có bốn chủng Streptomyces sp. 9.0.1, 9.0.6, 9.0.9 và 9.0.16 có hiệu quả đối kháng với hai chủng NdBT và NdGV (Figure 4). Trong khi đó, có đến 14 và 15 chủng trong số 20 chủng Bacillus spp. có khả năng đối kháng tương ứng với chủng nấm bệnh NdGV và NdBT. Với Trichoderma spp., tất cả 20 chủng được khảo sát đều có khả năng đối kháng với cả 2 chủng nấm bệnh. Trong số các chủng có khả năng đối kháng với nấm bệnh, hai chủng Streptomyces sp. (gồm 9.0.1 và 9.0.9), ba chủng Bacillus sp. (gồm 5.3.44, 5.3.54 và 5.3.68) và năm chủng Trichoderma sp. (gồm 8.3.5, 8.3.7, 8.3.14, 8.3.19 và 8.3.20) (Figure 5) cho hiệu quả đối kháng tốt với cả hai chủng nấm NdBT và NdGV (theo mức phân hạng của Nwankiti và Gwa 12 được chọn lọc để tiếp tục nghiên cứu.
Hiệu quả đối kháng của các chủng
Khả năng đối kháng của các chủng
Tiềm năng ứng dụng các chủng vi sinh vật đối kháng kiểm soát nấm bệnhN. Dimiditatum trên Thanh long
Hiệu quả đối kháng của các chủng vi sinh vật chọn lọc với hai chủng nấm bệnh trên môi trường thạch Thanh long
Trên môi trường trường thạch Thanh long, các chủng Bacillus sp. và Streptomyces sp. được chọn lọc đã mất khả năng đối kháng với hai chủng nấm bệnh NdBT và NdGV (Figure 6). Ngược lại, trên môi trường này, các chủng Trichoderma sp. chọn lọc vẫn thể hiện được khả năng đối kháng với hai chủng nấm bệnh (Figure 8, Figure 7). Ngoại trừ chủng Trichoderma sp. 8.3.5 có hiệu quả đối kháng tăng lên trên môi trường thạch Thanh long so với môi trường thạch khoai tây, hiệu quả đối kháng của bốn chủng Trichoderma sp. chọn lọc còn lại đều có xu hướng giảm từ mức tốt trên môi trường thạch khoai tây xuống mức trung bình trên môi trường thạch Thanh long (Table 1).
Hiện tượng mất hoạt tính đối kháng chủng
Hiệu quả đối kháng của năm chủng
Khả năng đối kháng của năm chủng
So sánh hiệu quả đối kháng của các chủng
| Chủng Trichoderma sp. | H (%) trên môi trường PGA | H (%) trên môi trường MTTL |
|---|---|---|
| 8.3.5 | 63,02b | 69,44a |
| 8.3.7 | 62,59a | 52,72b |
| 8.3.14 | 59,94a | 53,30b |
| 8.3.19 | 62,28a | 54,94b |
| 8.3.20 | 61,36a | 52,47b |
Khả năng tương thích của các chủng Trichoderma sp. chọn lọc
Bốn trong năm chủng Trichoderma sp. được chọn lọc khi được nuôi cấy đồng thời có khả năng tương thích với nhau một phần hay hoàn toàn, ngoại trừ các tổ hợp từ chủng 8.3.5 (gồm các tổ hợp các chủng 8.3.5 – 8.3.7, 8.3.5 – 8.3.14, 8.3.5 – 8.3.19 và 8.3.5 – 8.3.20) có hiện tượng ức chế từ xa (Table 2Figure 9).
Khả năng tương thíchcủa các chủng
| Chủng Trichoderma sp. | 8.3.5 | 8.3.7 | 8.3.14 | 8.3.19 | 8.3.20 |
| 8.3.5 | + + | ‒ – | ‒ – | ‒ – | ‒ – |
| 8.3.7 | ‒ – | + + | + + | + + | + |
| 8.3.14 | ‒ – | + + | + + | + | + |
| 8.3.19 | ‒ – | + + | + | + + | + |
| 8.3.20 | ‒ – | + | + | + | + + |
Khả năng tương thích của một số tổ hợp chủng
THẢO LUẬN
Mặc dù bệnh đốm trắng do N. dimidiatum trên Thanh long đã xuất hiện từ nhiều năm qua ở nhiều nước trên thế giới như Việt Nam, Trung Quốc, Mỹ, Thái Lan..., tuy nhiên, cho đến nay, chỉ có một số lượng ít các nghiên cứu phân lập và nhận diện tác nhân gây bệnh này như báo cáo của Mohd và cộng sự8, Thongkham, Soytong 2, Yi và cộng sự 1. Trong nghiên cứu này, 2 chủng nấm N. dimidiatum NdBT và NdGV đã được phân lập từ các mẫu Thanh long bị bệnh đốm trắng thu được từ Hàm Thuận Nam và Gò Vấp và nhận diện dựa trên trình tự gen ITS1 và ITS4. Cả 2 chủng nấm này đều có hình thái tương tự như mô tả của Thongkhamvà Soytong, Yi và cộng sự 1, 2, có khả năng gây bệnh trên cành Thanh long in vitro và in vivo với các triệu chứng tương tự như báo cáo của Mohd và cộng sự 8. Việc phân lập được N. dimidiatum đã giúp chủ động nguồn nấm cho các nghiên cứu các biện pháp kiểm soát bệnh do chúng gây ra.
Trước đây, các nghiên cứu của Luis và cộng sự5, Luong và cộng sự 6, Wan và cộng sự 4 đã cho thấy tiềm năng ứng dụng của Bacillus, Trichoderma và Streptomyces trong kiểm soát nấm bệnh N. dimidiatumin vitro. Trong nghiên cứu này, 20 chủng Trichoderma spp., 20 chủng Bacillus spp. và 20 chủng Streptomyces spp. đã được khảo sát hiệu quả đối kháng in vitro với hai chủng nấm bệnh N. dimidiatum NbBT và NdGV. Tuy nhiên, kết quả cho thấy chỉ có 20% chủng thuộc chi Streptomyces có khả năng đối kháng. Tỷ lệ các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng đối kháng là 75%, cao hơn nhiều so với Streptomyces. Trong khi đó, tất cả 20 chủng (100%) thuộc chi Trichoderma đều có khả năng đối kháng. Hiệu quả đối kháng trung bình của Trichoderma spp. cao hơn so với Bacillus spp. và Streptomyces spp (tương ứng là 56,8 %, 55,3% và 54,3%). Sự khác nhau trong khả năng đối kháng giữa các chủng vi sinh vật không cùng một chi và giữa các chủng trong cùng một chi được cho là do khả năng tiết ra các loại kháng sinh, các enzyme thủy phân vách nấm bệnh và khả năng tăng trưởng để cạnh tranh không gian sống và cạnh tranh dinh dưỡng khác nhau giữa các chủng 13. Kết quả này cho thấy ngoài khả năng tiết ra các hợp chất kháng sinh hay các enzyme như Bacillus và Streptomyces, các chủng Trichoderma còn có ưu thế phát triển hệ sợi nhanh giúp chúng tăng cường hiệu quả ức chế các nấm bệnh nhờ vào khả năng cạnh tranh không gian sống và dinh dưỡng. Ngoài ra, sự tiếp xúc trực tiếp của hệ sợi cũng có lẽ đã giúp Trichoderma tăng cường khả năng đối kháng thông qua khả năng ký sinh vào hệ sợi nấm N. dimidiatum12.
Tiềm năng ứng dụng vào thực tế được nghiên cứu bằng cách nuôi cấy kép các chủng có hiệu quả đối kháng cao với nấm bệnh trên môi trường thạch chứa nước chiết từ cành Thanh long. Trên môi trường này, các chủng vi sinh vật chọn lọc và nấm bệnh vẫn phát triển, tuy nhiên, kết quả quan sát cho thấy Trichoderma và nấm bệnh có hệ khuẩn ty với các sợi rất mãnh và mọc sát mặt thạch. Điều này có thể do trong nước chiết Thanh long có thành phần dinh dưỡng thấp hơn so với nước chiết khoai tây đã làm hạn chế sự tăng trưởng của các chủng vi sinh vật nói chung. Ngoài ra, có thể trong nước chiết Thanh long cũng có chứa hợp chất gây ức chế sự phát triển cả Trichoderma và hai chủng nấm bệnh NdBT và NdGV.
Đáng chú ý hơn, khi được nuôi cấy trên môi trường thạch nước chiết Thanh long, khả năng đối kháng với nấm bệnh của các chủng Bacillus sp. và Streptomyces sp. chọn lọc bị mất hoàn toàn trong khi hiệu quả đối kháng của các chủng Trichoderma sp. không thay đổi đáng kể. Khả năng đối kháng nấm bệnh của Bacillus và Streptomyces chủ yếu dựa trên khả năng sinh kháng sinh 6, 5. Hiện tượng mất khả năng đối kháng có thể là do các chủng Bacillus sp. và Streptomyces sp. bị mất khả năng tiết kháng sinh khi được nuôi cấy trên môi trường thạch nước chiết Thanh long. Trong khi đó, do có sự tiếp xúc trực tiếp của hệ sợi, các chủng Trichoderma sp. có thể đã ký sinh trên nấm bệnh 12. Khả năng ký sinh trên nấm bệnh của Trichoderma nhờ chúng tiết các enzyme có khả năng phân hủy vách tế bào 4 để sử dụng các chất dinh dưỡng bên trong nấm bệnh, qua đó đã giữ được khả năng đối kháng của chúng với nấm bệnh.
Các kết quả đã cho thấy 5 chủng Trichoderma được chọn lọc có tiềm năng ứng dụng vào thực tế hơn so với các chủng Bacillus và Streptomyces được nghiên cứu. Tuy nhiên, các kết quả khảo sát khả năng tương thích cho thấy chủng Trichoderma sp. 8.3.5 là chủng có hiệu quả đối kháng cao nhất lại không có khả năng tương thích với các chủng còn lại. Điều này là phù hợp vì chủng 8.3.5 có hoạt tính đối kháng mạnh nhất (trong đó có khả năng chủng 8.3.5 đã tổng hợp những hợp chất kháng sinh mạnh hơn) nên dẫn đến ức chế những chủng còn lại. Tuy nhiên, khó có thể xác định chính xác tương thích giữa các loài nếu chỉ dựa vào biểu hiện bên ngoài khuẩn lạc. Vì các chủng Trichoderma sp. có những đặc điểm hình thái gần giống nhau như màu sắc, hình dạng khuẩn ty và bào tử... Do đó, các đánh giá ở mức tương thích hoàn toàn và tương thích một phần chỉ mang tính chất tương đối và cần nghiên cứu sâu hơn.
KẾT LUẬN
Đã phân lập được hai chủng nấm N. dimidiatum NdBT và NdGV từ mẫu Thanh long bị bệnh đốm trắng ở Hàm Thuận Nam (Bình Thuận) và Gò Vấp (Thành phố Hồ Chí Minh). Tỷ lệ chủng có khả năng đối kháng với N. dimidiatum trong số 20 chủng Trichoderma spp., 20 chủng Bacillus spp. và 20 chủng Streptomyces spp. được khảo sát tương ứng 100%, 75% và 20%. Trichoderma spp. có hiệu quá đối kháng trung bình cao nhất, lần lượt đến Bacillus spp. và Streptomyces spp. Các kết quả thực nghiệm đã cho thấy năm chủng Trichoderma sp. (gồm 8.3.5, 8.3.7, 8.3.14, 8.3.19 và 8.3.20) có khả năng đối kháng tốt với hai chủng nấm N. dimidiatum NdBT và NdGV (hơn 60%). Đặc biệt, cả năm chủng chọn lọc vẫn giữ được hoạt tính đối kháng trên môi trường thạch nước chiết Thanh long đã cho thấy tiềm năng ứng dụng các chủng này để kiểm soát bệnh đốm trắng do nấm N. dimidiatum trên cây Thanh long ngoài đồng ruộng. Ngoài ra, khả năng tương thích giữa các chủng Trichoderma sp. 8.3.7, 8.3.14, 8.3.19 và 8.3.20 cũng cho thấy tiềm năng được sử dụng phối hợp với nhau để tăng cường khả năng kiểm soát bệnh do nấm N. dimidiatum.
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CT : Môi trường thạch cao - thịt pepton
ITS : Internal Transcribed Spacer
MTTL : Môi trường thạch nước chiết Thanh long
NdBT : Chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum NdBT
NdGV : Chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum NdGV
PGA : Môi trường thạch nước chiết khoai tây
XUNG ĐỘT LỢI ÍCH
Bài báo được dựa trên các kết quả nghiên cứu thực nghiệm hoàn toàn trung thực và được nhóm tác giả thống nhất đồng ý công bố mà không có bất kỳ tác động xung đột lợi ích nào.
ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ
Nguyễn Như Nhứt: tư vấn, thực nghiệm và thu thập số liệu, tổng hợp số liệu; viết, trình bài và chỉnh sửa bài báo
Nguyễn Thị Ngọc Bích, Nguyễn Thanh Trường: thực nghiệm và thu thập số liệu
Võ Thị Xuyến : tư vấn