Sàng lọc chọn lựa và thu thập đối tượng nghiên cứu

Đến nay, rất ít công trình nghiên cứu về hoạt tính ức chế enzyme urease của các dược liệu Việt Nam. Quy trình chọn lựa mẫu dược liệu Việt Nam phụ thuộc vào các tiêu chí chọn đặc thù riêng. Yếu tố lựa chọn đầu tiên (PPLC1) là tham khảo các nghiên cứu khoa học trước đây về dược liệu có hoạt tính ức chế enzyme urease, ức chế sự phát triển của vi khuẩn H.pylori và các nghiên cứu in vivo về khả năng chống loét dạ dày ở động vật thực nghiệm. Dựa theo phương pháp chọn lựa này, 17 loài đã được tìm thấy gồm Cần tây (Apium graveolens), Chè xanh (Camellia sinensis), Dâu tằm (Morus alba), Cà dại hoa trắng (Solanum torvum), Dã quỳ (Tithonia diversifolia), Đậu phộng (Arachis hypogaea), Khế chua (Averrhoa carambola), Trâu cổ (Ficus pumila), Sung (Ficus racemosa), Trứng cá (Muntingia calabura), Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria), Riềng (Alpinia officinarum), Ngải bún (Boesenbergia pandurata), Nghệ vàng (Curcuma longa), Ngải đen (Kaempferia parviflora), Mã đề (Plantago major) và Gừng gió (Zingiber zerumbet). Ngoài sự chọn lựa cây thuốc dựa theo các nghiên cứu khoa học liên quan, phương pháp sàng lọc dược liệu theo công dụng dân gian điều trị các bệnh đau dạ dày – tá tràng, các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa như rối loạn tiêu hóa, lợi tiểu, các bệnh liên quan đến gan, thận (PPLC2). Dựa vào phương pháp sàng lọc này, 15 loài được tìm thấy gồm Cà phê (Coffea arabica), Xáo tam phân (Paramignya trimera), Rau má (Centella asiatica), Vối (Cleistocalyx operculatus), Mật gấu (Gymnanthemun amygdalinum), Keo ong dú (Trigona minor), Chùm lé (Azima sarmentosa), Ngành ngạnh (Cratoxylum prunifolium), Nghệ trắng (Curcuma aromatica), Nghệ lầu (Curcuma xanthorrhiza), Nghệ đen (Curcuma zedoaria), Mướp đắng (Momordica charantia), Gừng dại (Zingiber cassumunar), Đinh lăng (Polyscias fruticosa) và Gùi đỏ (Willughbeia cochinchinensis). Ngoài ra, phương pháp lựa chọn ngẫu nhiên (PPLC3) cũng được thực hiện góp phần làm phong phú mẫu thử. Các loài thực vật được lựa chọn theo phương pháp này gồm nấm Ngọc cẩu (Cynomorium songarium), Thông đỏ (Taxus wallichiana), Xẩu hổ (Mimosa pudica), Thuốc dòi (Pouzolzia zeylanica), Sao đen (Hopea odorata), Móc mèo (Caesaipinia bonducella), Săng mã (Carallia brachiata), Trâm bầu (Combretum quadrangulare), Gắm (Gnetum montanum), Cò ke (Microcos paniculata), Duối ô rô (Streblus ilicifolia) và Sến đỏ (Shorea roxburghii) (Table 1).

44 loài thực vật được lựa chọn và thu hái ở các khu vực bao gồm Thành phố Đà Lạt, Tỉnh Lâm Đồng; Thành phố Buôn Ma Thuột, Tỉnh Đắk Lắk; Huyện Trảng Bom, Tỉnh Đồng Nai; Thành phố Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh; Huyện Giồng Trôm, Tỉnh Bến Tre; Huyện Tịnh Biên, Tỉnh An Giang; Huyện U Minh Thượng, Tỉnh Cà Mau và Thành phố Phú Quốc, Tỉnh Kiên Giang từ tháng 6 đến tháng 12 năm 2022. Trong đó có 2 loài sử dụng 2 bộ phận dùng khác nhau. Các mẫu cây nghiên cứu được định danh bởi GS.TS. Trần Công Luận, Trường Đại học Tây Đô, Cần Thơ. Các mẫu được mã hóa và lưu giữ tại Bộ môn Hóa Dược, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Table 1).

Hóa chất và thiết bị

Enzyme urease chiết xuất từ Đậu rựa (Canavalia ensiformis) (9002-13-5), urea (57-13-6, >99,5%) và hydroxyurea (127-07-1, 98%) được mua từ Sigma – Aldrich. Phenol đỏ được cung cấp bởi Scharlau, NaHPO.2HO, NaHPO.12HO, DMSO, methanol và ethanol xuất xứ từ Trung Quốc, độ tinh khiết > 99%. Cuvette thủy tinh 1,5 mL của Hellma (Đức), máy quang phổ UV-1800 của SHIMADZU (Nhật Bản).

Điều chế mẫu cao chiết

Các mẫu cây tươi sau khi thu hái được tiến hành phơi khô tự nhiên và cắt nhỏ. Tiến hành trích Soxhlet khoảng 100 g mẫu dược liệu khô với 500 mL dung môi methanol trong 8 h liên tục. Dịch chiết được cô quay dưới áp suất kém thu hồi dung môi, sau đó tiến hành đông khô đến khối lượng không đổi thu được các mẫu cao chiết dùng cho thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme urease.

Nguyên tắc thử hoạt tính ức chế enzyme urease

Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme urease được thực hiện bằng phương pháp trắc quang. Chất nền urea bị enzyme urease thủy phân sinh ra ammoniac (Figure 1). Hàm lượng ammoniac sinh ra này được xác định bằng cách sử dụng thuốc thử phenol đỏ để xác định hoạt tính của mẫu thử. Phenol đỏ (phenolsulfonphthalein – CHOS) là một chất chỉ thị acid base và là một acid yếu, có màu vàng trong môi trường acid với bước sóng hấp thu cực đại tại 433 nm và màu hồng trong môi trường base với bước sóng hấp thu cực đại tại 556 nm. Lượng ammoniac sinh ra tạo môi trường base và sẽ làm thuốc thử phenol đỏ chuyển hoá thành dạng base liên hợp. Khi mẫu thử có khả năng ức chế enzyme urease sẽ làm giảm hàm lượng ammoniac sinh ra và làm giảm cường độ màu của thuốc thử phenol đỏ của dung dịch. Dựa vào cường độ màu của dung dịch khi có và không có chất ức chế sẽ tính được giá trị phần trăm ức chế enzyme urease của mẫu thử tại nồng độ khảo sát.

Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme urease

Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme urease được thực hiện dựa trên quy trình tham khảo10 và được tối ưu hóa các điều kiện phòng thí nghiệm. Cụ thể, mẫu cao chiết tại các nồng độ thử nghiệm khác nhau được ủ với 50 μL enzyme urease 30 U/mL trong môi trường đệm phosphate pH 7,0 (0,01 M) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Dung dịch sau đó được thêm tiếp 500 μL urea 60 mM và tiếp tục ủ 20 phút. Sau đó, cho 30 μL thuốc thử phenol đỏ (1 mg/mL) vào hỗn hợp sau phản ứng, lắc đều, ủ trong 10 phút và đo độ hấp thu quang ở bước sóng 556 nm. Mẫu trắng được thực hiện tương tự như mẫu thử nhưng không có enzyme. Mẫu đối chứng được thực hiện tương tự như trên nhưng không cho mẫu thử. Mỗi mẫu cao chiết được được hòa tan trong đệm phosphate pH 7,0 (0,01 M) chứa 0,03% DMSO và pha loãng tại các nồng độ thử nghiệm 250, 100, 50, 25 và 10 μg/mL, thực hiện khảo sát mỗi nồng độ được đo 3 lần. Kết quả được đánh giá thông qua giá trị phần trăm ức chế I (%) và giá trị IC. Trong quy trình này, hydroxyurea được sử dụng làm chất đối chứng dương.

Đánh giá hoạt tính ức chế

Khả năng ức chế của mẫu khảo sát được tính dựa trên phần trăm ức chế I (%) theo công thức:

I (%) = (A đối chứng - A mẫu thử)x100%/A đối chứng

Trong đó, A đối chứng là giá trị mật độ quang của dung dịch không chứa mẫu khảo sát và A mẫu thử là giá trị mật độ quang của dung dịch chứa mẫu khảo sát. Dựa vào giá trị phần trăm ức chế I tại các nồng độ thử nghiệm sẽ tìm được giá trị nồng độ ức chế được 50% enzyme urease trong thí nghiệm này, gọi là giá trị IC.

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần và hoàn toàn ngẫu nhiên. Phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel 365. Sử dụng phương pháp phân tích phương sai một chiều (ANOVA), kết quả được tính dựa trên giá trị trung bình với độ lệch chuẩn (p < 0,05) cho thấy ý nghĩa thống kê.

Thử nghiệm sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme urease

Tất cả các cao chiết methanol của 44 loài thực vật được thử hoạt tính ức chế enzyme urease tại nồng độ 250 μg/mL. Trong 19 cao chiết của 17 loài được lựa chọn theo PPCL1, có 7 cao chiết (chiếm 37,8%) có khả năng ức chế hơn 50 % enzyme (Figure 2, Table 2). Cao chiết lá Chè xanh (C. sinensis) ức chế enzyme mạnh nhất với 89,5%, điều này chứng minh phương pháp nghiên cứu này phù hợp với công bố trước đây5. Theo PPCL2, đã tìm thấy 4/15 loài (chiếm 26,7%) có khả năng ức chế 50% enzyme. Hoạt tính ức chế enzyme urease của củ Nghệ trắng (C. aromatica) thể hiện tốt nhất, ở nồng độ 250 μg/mL ức chế 86,5%. (Figure 3, Table 2) cho thấy tiềm năng của củ Nghệ trắng trong các nghiên cứu tiếp theo liên quan đến khả năng điều trị bệnh viêm loét dạ dày do vi khuẩn H.pylori gây ra. Đối với PPLC3, 4/12 cao chiết (chiếm 33,3%) có khả năng ức chế hơn 50% enzyme. Thân Trâm bầu (C. quadrangulare) và thân Sến đỏ (S. roxburghii) có tiềm năng ức chế enzyme này rất tốt với giá trị phần trăm ức chế lần lượt là 90,4 và 83,2% (Figure 4, Table 2). Tóm lại, thử nghiệm sàng lọc khả năng điều trị bệnh viêm loét dạ dày do H.pylori thông qua mô hình thử nghiệm ức chế enzyme urease của 44 loài đã tìm thấy 15 loài có tiềm năng ức chế hơn 50% enzyme urease ở nồng độ 250 μg/mL để thử nghiệm đánh giá sâu hơn.

Các cao chiết tiềm năng được thử nghiệm ở nồng độ thấp hơn 100, 50, 25 và 10 µg/mL. Tại nồng độ 100 µg/mL, 15 cao chiết này đều có khả năng ức chế enzyme và 5/15 mẫu ức chế hơn 50% enzyme urease. Tại nồng độ 50 và 25 µg/mL, 15 cao chiết đều có khả năng ức chế enzyme và có 1 mẫu ức chế hơn 50% enzyme urease. Tại nồng độ 10 µg/mL, có 6/15 mẫu cây có khả năng ức chế enzyme này (Table 3). Kết quả đánh giá cho thấy cao chiết methanol của củ Nghệ trắng (C. aromatica) có hoạt tính mạnh nhất với giá trị IC là 22,5 µg/mL, so với chất đối chứng dương hydroxyurea (IC = 6,5 µg/mL). Tiếp theo đó là các cao chiết methanol của thân Trâm bầu (C. quadrangulare), thân Sến đỏ (S. roxburghii), lá Chè xanh (C. sinensis) và hạt Móc mèo (C. bonducella) với IC lần lần là 58,5, 80,8, 86,6 và 97,7 µg/mL. Trong khi đó, 10/15 mẫu cây còn lại có hoạt tính trung bình với giá trị IC từ 170 - 240µg/mL. Kết quả hoạt tính này kết hợp với PPLC1 cho phép đề nghị củ Nghệ trắng, vỏ hạt Đậu phộng, lá và hoa Khế chua, thân Trâu cổ, củ Nghệ vàng và củ Ngải đen ức chế sự phát triển vi khuẩn H.pyloritheo cơ chế phụ thuộc vào enzyme urease. Theo PPLC2, quả Sao đen, củ Gừng dại và quả Mướp đắng được lựa chọn có thể điều trị bệnh về viêm loét dạ dày và các bệnh liên quan đường tiêu hóa có thể theo cơ chế ức chế enzyme urease. Đối với PPLC3, thân Trâm bầu, thân Sến đỏ và hạt Móc mèo là ba loài cây mới lần đầu tiên được phát hiện có khả năng ức chế enzyme urease.

Tìm hiểu thành phần hóa học các dược liệu có tác dụng ức chế enzyme urease mạnh (IC < 100µg/mL) cho thấy các dược liệu Trâm bầu, củ Nghệ trắng, hạt Móc mèo có thành phần chính là terpenoid50, 51, 52, 53, 54, 55, 56. Lá Chè xanh chứa hàm lượng lớn các hợp chất flavonoid46, 57 và diarylheptanoid được tìm thấy rất nhiều trong củ Nghệ vàng (C. longa)58 và củ Nghệ trắng (C. aromatica)52, 53. Các hợp chất này được dự đoán rất có tiềm năng trong việc hỗ trợ và điều trị các bệnh viêm loét dạ dày do nhiễm khuẩn H.pylori. Điển hình, hợp chất diarylheptanoid (-)-hannokinol từ củ Nghệ trắng (C. aromatica) đã được báo cáo ức chế enzyme urease với giá trị IC 244,4 µM59. Bên cạnh đó, cây Sến đỏ chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Trong số các loài được tìm thấy có hoạt tính, ngoài lá Chè xanh đã được chứng minh có tác dụng ức chế urease trong các nghiên cứu trước đây, bốn loài còn lại là lần đầu tiên được đánh giá tác dụng ức chế enzyme urease cũng như ức chế vi khuẩn H.pylori.