Neo xuyên màng ở đầu N

Sự tiết protein vào môi trường ngoại bào thông qua con đường Sec phụ thuộc vào SPase tạo điều kiện giải phóng protein trưởng thành bằng cách tách SP ở đầu N từ preprotein (SP+protein tiết)3. Tuy nhiên, ở cơ chế neo xuyên màng ở đầu N, trình tự amino acid trong peptide tín hiệu ở preprotein thiếu vị trí phân cắt của SPase, dẫn đến sự hình thành neo trong đó protein sẽ được gắn vào thành tế bào bởi các liên kết không cộng hóa trị. Trong trường hợp này, SP không được phân cắt với liên kết kỵ nước ở trung tâm sẽ có chức năng như một chuỗi xoắn xuyên màng ở đầu N có thể gắn protein vào màng. Để có thể hình thành được neo xuyên màng đầu N, protein mục tiêu cần phải được dung hợp với chuỗi neo có độ dài thích hợp. Một neo ngắn sẽ có khả năng bảo vệ protein mục tiêu bằng cách chèn hoàn toàn vào thành của tế bào, nhưng hạn chế là thiếu khả năng tiếp cận. Poquet và cộng sự (1998) đã xác định được hai đoạn gene có nguồn gốc từ Lactococcus mã hóa cho các neo có kích thước đa dạng từ 40 đến 234 amino acid dựa trên phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên với tín hiệu xuất thu nhận từ thư viện gene của L. lactis và sử dụng nuclease của Staphylococcus aureus làm reporter protein. Một trong những neo xoắn xuyên màng ở đầu N được khai thác nhiều nhất là protein PgsA từ B. subtilis, bao gồm một vùng xuyên màng dài từ 25 đến 44 amino acid được phân tích bởi hệ thống SOSUI. Protein PgsA đã được chứng minh là một phần của phức hợp poly-γ-glutamate synthetase và có chức năng ổn định phức hợp bằng cách neo vào trong màng của tế bào. Narika đã chỉ ra rằng sự dung hợp của α-amylase vào đầu C của PgsA dẫn đến việc biểu hiện thành công trên bề mặt E. coli và L. casei 38. Việc định vị protein dung hợp PgsA-AmyA-FLAG trên bề mặt tế bào sẽ được phát hiện bằng phương pháp flow cytometry và miễn dịch huỳnh quang. Các tế bào L. casei biểu hiện AmyAF trên bề mặt thể hiện hoạt động thủy phân tăng đáng kể so đối với tinh bột dạng hòa tan. Gần đây, một neo xuyên màng từ Lp-1568, đây là một protein neo đầu N và có nguồn gốc từ L. plantarum đã được ứng dụng để biểu hiện các phiên bản dài và ngắn của invasin (Inv và InvS tương ứng) từ tác nhận gây bệnh ở người là Yersinia pseudotuberculosis trên bề mặt của tế bào vi khuẩn L. plantarum. Sự định vị trên bề mặt của cả hai phiên bản invasin đã được xác nhận bằng phương pháp flow cytometry và miễn dịch huỳnh quang, nhưng chỉ có InS được neo bởi Lp-1568 mới có hoạt động NF-kB trong dòng tế bào monocytic 39. Các kết quả được công bố nêu trên cho thấy chiến lược neo xuyên màng ở đầu N-terminal để biểu hiện các protein ngoại lai trên bề mặt tế bào LAB là một phương pháp có nhiều tiềm năng.

Neo gắn miền trung gian

Sự hình thành liên kết không cộng hóa trị trong chiến lược gắn protein ngoại lai vào thành tế bào có thể thu được bằng cách sử dụng các domain gắn thành tế bào khác nhau như surface (S)-layer protein (SLP), domain LysM hoặc domain WxL40, 41, 42. Các S-layer là mạng lưới các đơn phân của tiểu đơn vị protein hoặc glycoprotein với trọng lượng phân tử 40−200 kDa 43. Cấu trúc S-layer gồm hai vùng chức năng là domain tự lắp ráp và domain gắn tế bào, chịu trách nhiệm cho quá trình neo vào bề mặt tế bào thông qua việc hình thành các liên kết không cộng hóa trị với cấu trúc trên bề mặt của tế bào, thường là với lipopolysaccharide (LPS) có sẵn trong vi khuẩn Gram âm và với các polysaccharide có trên thành tế bào ở vi khuẩn Gram dương 42. Những vùng này đã được mô tả rõ ràng trong S-layer protein S của L. acidophilus ATCC 4356 44, SlpA của L. brevis ATCC 828745 và CbsA của L. crispatus JCM 5810 46. Các nghiên cứu đã chứng minh S-layer protein trong một số loài Lactobacillus có trọng lượng phân tử nhỏ (25−71 kDa), giá trị pI cao 9,35−10,4 47 và chiếm 10−15% tổng số protein. So với SLP từ các loài khác sử dụng motif tương đồng lớp S (S-layer homology, SLH) cho sự gắn kết không cộng hóa trị vào thành tế bào, thì SLP từ Lactobacillus đóng vai trò là trung gian cho quá trình gắn kết với thành tế bào thông qua tương tác giữa các amino acid cơ bản trong vùng gắn kết với thành tế bào và các polymer thành tế bào tích điện âm như lipoteichoic acid hoặc teichoic acid 48. Các tính năng khác biệt kể trên của SLP từ Lactobacillus đã mang đến nhiều tiềm năng trong khai thác các cognate promoter và SP có nguồn gốc từ SLP để biểu hiện và tiết các protein ngoại lai trong LAB, cũng như sử dụng SLP làm chất mang cho biểu hiện protein ngoại lai trên bề mặt của Lactobacilus và Lactococcus 48, 49, 50. Một số SLP trong các loài Lactobacillus đã được nghiên cứu rộng rãi cho các mục đích khác nhau như: phương tiện để vận chuyển kháng nguyên, hoặc chất xúc tác sinh học toàn bộ tế bào 51. S-layer subunit (SlpA) của L. brevis đã biểu hiện thành công mô hình epitope ngoại lai trên bề mặt tế bào trong khi vẫn duy trì được cấu trúc mạng tinh thể của S-layer 52. Protein gắn collagen (collagen-binding protein, Cnb) từ L. reuteri NCIB 11951, vốn có quan hệ tương đồng khá gần với neo S-layer là BspA, đã được sử dụng làm protein neo để biển hiện β-glucanase trên bề mặt tế bào của L. reuteri Pg4. Vị trí trên bề mặt và khả năng phân hủyβ-glucan của β-glucanase biểu hiện trên bề mặt đã được công nhận 53. Một nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng SLP từ L. crispatus K2-4-3 được phân lập từ ruột gà có thể được sử dụng để biểu hiện các protein ngoại lai trên bề mặt của một số chủng Lactobacillus không có S-layer thí dụ như L. lactis, suy ra tiềm năng sử dụng neo SLP để biểu hiện trên bề mặt của bản thân vật chủ vốn không thể tự sản xuất ra SLP54.

Một phương pháp neo khác dựa vào liên kết không cộng hóa trị giữa protein với thành của tế bào là thông qua domain LysM. Đây là một module phổ biến trên thành tế bào, có khả năng phân hủy enzyme và protein, là tác nhân gây độc lực ở vi khuẩn 55. Các domain LysM với độ dài khác nhau từ 44 đến 65 amino acid, tồn tại một hoặc nhiều bản sao trong mỗi protein 3, thường hiện diện ở vùng đầu N hoặc đầu C của protein và gắn kết với peptidoglycan và chitin56. Khả năng gắn kết này của các domain LysM đã được áp dụng rộng rãi cho các chiến lược biểu hiện trên bề mặt không biến đổi gene dựa trên việc tạo ra protein dung hợp có chứa LysM trong một chủng chủ sản xuất, ví dụ như E. coli hoặc L. lactis, sau đó là cố định lên trên bề mặt một chủng chủ không tái tổ hợp nào đó ví dụ như LAB 57. Với phương pháp này, chủng chủ có thể được trộn lẫn với protein dung hợp đã hoặc chưa qua tinh sạch, và lượng protein được nạp lên trên bề mặt tế bào có thể được kiểm soát dễ dàng hơn khi được so sánh với cách biểu hiện tái tổ hợp thông thường3. Nhiều protein neo có chứa motif LysM đã được phát hiện và ứng dụng cho mục đích này57, 58. Neo protein (protein anchor, PA) AcmA có nguồn gốc từ peptidoglycan hydrolase của L. lactis là một ví dụ. Neo này chứa ba motif LysM dài 45 amino acid được phân tách bằng các spacer sequences. Bosma và cộng sự đã sử dụng PA để biểu hiện hoặc α-amylase (α-PA) hoặc β-lactamase (β-PA) trên bề mặt của các tế bào lactococcus đã qua xử lý bằng acid. Cả hai enzyme đều hoạt động khi chúng được neo một cách vô tình bởi PA. Raha và cộng sự (2005) cũng đã sử dụng chuỗi lặp lại 255 bp của vùng gắn kết với thành tế bào của protein AcmA đã được đề cập ở trên để biểu hiện vùng A1 và A3 của protein VP1 của enterovirus 71 (EV71) trên bề mặt. Việc biểu hiện thành công các epitope VP1 của EV71 trên bề mặt của L. lactis được xác nhận bằng whole-cell ELISA đã mở ra hướng mới để phát triển vaccine uống. Một ví dụ khác liên quan đến chiến lược không biến đổi gene này là MurO từ L. plantarum hoặc Ly5C từ L. fermentum khi biểu hiện thành công β-galactosidase trên bề mặt L. plantarum59, hoặc trên các tế bào LAB 58 khi ứng dụng trên phạm vi rộng hơn. Các nghiên cứu này cung cấp phương thức gắn protein ngoại lai trên bề mặt của các chủng lợi khuẩn LAB không sử dụng phương pháp biến đổi gene.

Neo lipoprotein

Liên kết cộng hóa trị với màng tế bào có thể được hình thành qua các neo lipoprotein, thường bao gồm một SP ở đầu N có chứa motif lipobox trong vùng đầu C. Sau khi tiết ra protein theo con đường Sec, một diacylglycerol transferase xúc tác việc gắn cộng hóa trị một cysteine bảo tồn trong lipobox với một phospholipid trong lớp màng, trong khi SP được loại bỏ bởi peptidase đặc hiệu của lipobox. Do đó, việc neo protein tái tổ hợp vào màng tế bào có thể đạt được bằng cách dung hợp một protein ngoại lai ở vùng hạ lưu của một neo lipoprotein thích hợp. Việc sử dụng neo lipoprotein để biểu hiện protein ngoại lai trong LAB đã nhận được tương đối ít sự chú ý so với các phương pháp biểu hiện trên bề mặt khác. Trong L. plantarum, hai neo lipoprotein khác nhau là Lp-1261 và Lp-1452 có nguồn gốc tương ứng từ oligopeptide ABC transporter (Lp-1261) và peptidylprolyl isomerase PrsA (Lp-1452), đã được sử dụng để biểu hiện trên bề mặt một đoại dài (Inv) và một đoạn ngắn (InvS) của extracellular domain của invasin từ tác nhân gây bệnh Yersinia pseudotuberculosis trên người. SP và vùng của domain xúc tác chịu trách nhiệm cho quá trình neo cộng hóa trị vào lớp ngoài của màng plasma thông qua cysteine ở đầu N đã bị chuyển hóa lipid. Sự biểu hiện thành công lên bề mặt của Inv và InvS trên bề mặt tế bào Lactobacillus của cả hai neo Lp-1261 và Lp-1452 đã được xác nhận bằng phân tích miễn dịch huỳnh quang và flow cytometry. Đáng chú ý, cả hai neo lipoprotein cho kết quả hoạt động tốt nhất trong số các neo đã được thử nghiệm vốn chứa invasin nguyên bản có cấu trúc khá lớn và gây ra phản ứng viêm mạnh mẽ 39. Trong một nghiên cứu khác, Kuczkowska và cộng sự 60 cũng đã sử dụng hai neo Lp-1261 và Lp-1452 để gắn CCL3Gag, là loại protein dung hợp bao gồm kháng nguyên HIV-1 Gag bị cắt ngắn và chemokine CCL3 của chuột, lên trên bề mặt của L. plantarum NC8. Kết quả nghiên cứu cho thấy không thể xác định vị trí gắn trên bề mặt của protein neo Lp-1261 khi quan sát bằng kính hiển vi, có thể là do quá trình tiết protein hiệu quả thấp, có quá nhiều vị trí chèn vô thành của tế bào. Trong khi đó, các tế bào vi khuẩn biểu hiện CCL3Gag bằng neo Lp-1452 cho thấy tín hiệu huỳnh quang mạnh hơn nhiều, có thể do Lp-1452 giúp cho domain CCL3 tiếp xúc nhiều hơn với kháng thể.

Neo LPxTG

Một neo khác, trong đó có sự hình thành liên kết cộng hóa trị với thành tế bào, có thể được tạo ra bằng cách sử dụng con đường sortase (SrtA) 61. Cụ thể, protein tiết ra mang một neo ở đầu C, mà bản thân neo này có chứa motif LPxTG (LPQTxE trong L. plantarum), theo sau là một domain kỵ nước và một đuôi tích điện dương. Domain kỵ nước và đuôi tích điện giữ cho protein không bị giải phóng vào môi trường do đó cho phép nhận ra motif LPxTG bởi một transpeptidase liên quan đến màng gọi là sortase33. Sortase xúc tác phản ứng cắt liên kết peptide, thí dụ như liên kết giữa threonine và glycine trong motif LPxTG và liên kết giữa threonine ở đầu C của protein bề mặt với cầu nối pentapeptide của peptidoglycan 62. Phản ứng đặc hiệu này đã được khai thác hàng loạt trong lĩnh vực công nghệ sinh học như tổng hợp nên các liên kết nucleic acid-peptide và neoglycoconjugate, tuần hoàn protein, đánh dấu protein bề mặt tế bào trên tế bào sống, phương tiện phân phối vaccine sống và xúc tác sinh học toàn tế bào63. Piard và các đồng nghiệp đã kết luận rằng hiệu quả neo của protein M6 từ Streptococcus pyogenes với thành tế bào cho kết quả rất khác biệt trong các chủng chủ khác nhau bao gồm L. lactis, L. fermentum, L. sake và S. thermophilus. Dieye và cộng sự28 nghiên cứu về biểu hiện thành công nucease NucA trên bề mặt của tế bào vi khuẩn L. lactis bằng cách sử dụng tín hiệu phân loại (sorting signal) ở đầu C của protein M6. Các tác giả này đã có một đánh giá tổng quan về trọng lượng phân tử của các protein dung hợp có chứa neo với thành tế bào của protein M6. Các dải có trọng lượng phân tử lớn đã được phát hiện trong mảnh vỡ thành tế bào cho thấy sự hiện diện của các mảnh peptidoglycan có kích thước khác nhau được liên kết cộng hóa trị với protein bề mặt. Turner và các đồng nghiệp 64 đồng ý với quan sát trên khi protein dung hợp Mlp-His6 chứa tín hiệu neo với thành tế bào là LPxTG được phát hiện bằng kỹ thuật Western blot với khối lượng phân tử cao hơn. Các tác giả phỏng đoán kết quả trên có được là do quá trình glycosyl hóa protein này. Gần đây, một neo vách tế bào mới từ L. plantarum WCFS1 đã được tìm thấy và sử dụng trong biểu hiện 37-kDa oncofetal antigene (OFA) trên bề mặt tế bào L. plantarum WCFS165. Dựa trên trình tự của Lp-2578, là một protein được ghi nhận là protein “bám dính” trên bề mặt của thành tế bào từ L. plantarum WCFS1, Fredriksen và các cộng sự đã thiết kế ba neo chứa LPxTG với độ dài khác nhau tương ứng với vùng có độ phức tạp thấp (low-complexity region) đã bị cắt ngắn, vùng có độ phức tạp thấp còn nguyên vẹn và gần như là protein hoàn chỉnh. Dữ liệu từ nghiên cứu đã cho thấy rằng sự khác biệt về chiều dài của neo ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình neo và độ ổn định của protein; tuy nhiên sự khác biệt này không lớn cũng như không rõ ràng để dự đoán.

Đáng chú ý là trong một nghiên cứu gần đây của Hoàng Minh và cộng sự 14, hệ thống vector pSIP đã được sử dụng để nghiên cứu chức năng của hai phương pháp gắn cộng hóa trị để biểu hiện các enzyme liên quan đến lĩnh vực thực phẩm như mannanase hoặc chitosanase trên bề mặt tế bào của L. plantarum như là chất xúc tác sinh học toàn tế bào (Figure 3). Hai khác biệt chính khi so sánh hai phương pháp này là: (i) Protein được gắn vào màng hoặc thành tế bào, kết quả là phương pháp neo vào thành tế bào qua trung gian sortase sẽ biểu hiện nhiều protein ngoại vi hơn phương pháp còn lại; (ii) Đầu N của protein được gắn vào bề mặt của tế bào trong phương pháp sử dụng lipobox, còn phương pháp neo vào vách tế bào qua trung gian sortase lại gắn protein ở đầu C. Việc sử dụng hai phương pháp neo cộng hóa trị này để biểu hiện các protein mục tiêu khác nhau trên bề mặt tế bào Lactobacillus đã cho cái nhìn sâu sắc và toàn diện về hệ thống neo của vi khuẩn.