MỞ ĐẦU

Bồng bồng (Calotropis gigantea) là cây bụi thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae), mọc nhiều ở khu vực châu Á như Trung Quốc, Indonesia, Ấn Độ và Philippines 1. Ở nước ta, cây mọc rất phổ biến, thường ở những nơi có cát thuộc các tỉnh ven biển như Bình Thuận, Nghệ An, Hà Tĩnh. Trong dân gian, cây được sử dụng trong một số bài thuốc để điểu trị các bệnh như cảm, ho, hen suyễn hay viêm phế quản 2. Các nghiên cứu trước đây các bộ phận khác nhau như rễ, thân, lá, hoa cho thấy các hợp chất chính trong cây là cardenolide, pregnane, flavonoid, và phenol 3. Hơn nữa, các nghiên cứu cho thấy cây Bồng bồng có nhiều hoạt tính sinh học hấp dẫn như hoạt tính kháng khuẩn 4, 5, kháng viêm6, 7, kháng ung thư8, 9, 10. Trong quá trình phân lập các hợp chất từ cây cỏ Việt Nam, nhóm nghiên cứu đã phát hiện cây Bồng bồng có hoạt tính gây độc đáng kể trên tế bào ung thư tuyến tụy PANC-111, 12, 13. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây chỉ tập trung trên bộ phận lá và rễ. Do đó, bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của hoa cây Bồng bồng nhằm tìm ra các hợp chất có hoạt tính mạnh trên tế bào ung thư tuyến tụy (Figure 1).

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Chiết xuất và phân lập các hợp chất

Từ 10 kg bột khô hoa cây Bồng bồng (Calotropis gigantea), đun hoàn lưu với MeOH (3 L, 3 h x 3). Dịch trích được thu hồi dung môi dưới áp suất kém, thu được cao thô MeOH (3,7 kg). Cao thô MeOH được phân tán hoàn toàn vào nước và được chiết lỏng‒lỏng MeOH lần lượt với các dung môi -hexane, CHCl, EtOAc thu các cao tương ứng: cao n-hexane (221 g), cao CHCl (88 g), cao EtOAc (73 g) và cao nước (3,2 kg).

Cao CHCl (88 g) được sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi n-hexane–EtOAc (0–100% EtOAc), thu được 12 phân đoạn (1–12). Phân đoạn 8 (6,6 g) được sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi -hexane–EtOAc (0–100% EtOAc), thu được 5 phân đoạn (8.1–8.5). Phân đoạn 8.3 (2,4 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel pha thường bằng hệ dung môi -hexane–acetone (0–100% acetone), thu được hợp chất 1 (3,0 mg) và 2 (4,0 mg) và 3 (4,0 mg). hân đoạn 8.4 (1,8 g) được sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi -hexane–CHCl–MeOH (80:15:5, v/v/v) kết hợp với sắc ký lớp mỏng điều chế với hệ dung môi MeOH–CHCl (v/v, 5:95) thu được hợp chất 4 (3,5 mg) và 5 (3,0 mg).

Pollenopyrroside B (1): HRESIMS: m/z 276,0854 [M+Na] (CHNONa, 276,0842); H NMR (500 MHz, acetone-d): δ (J, Hz) 2,14 (1H; dd; 14,0; 3,0; H-3’a); 2,39 (1H; dd; 14,0; 8,0; H-3’b); 3,61 (1H; m; H-6’a); 3,69 (1H; dd; 12,0; 4,2; H-6’b); 4,10 (1H; q; 4,2; H-5’); 4,19 (1H; d; 14,0; H-1’a); 4,35 (1H; brs; H-4’); 4,53 (1H; d; 14,0; H-1’b); 4,84 (1H; d; 15,5; H-6a); 4,99 (1H; d; 15,5; H-6b); 6,05 (1H; d; 4,0; H-4); 6,98 (1H; d; 4,0; H-3); 9,46 (1H; s; 2-CHO). C NMR (125 MHz, acetone-d): δ 179,1 (C-7); 136,0 (C-5); 132,3 (C-2); 124,3 (C-3); 105,4 (C-4); 104,2 (C-2’); 89,6 (C-5’); 72,3 (C-4’); 62,9 (C-6’); 58,4 (C-6); 51,8 (C-1’); 45,4 (C-3’).

epi-Acortatarin A (2): HRESIMS: m/z 254,1035 [M+H] (CHNO, 254,1023); H NMR (500 MHz, acetone-d): δ (J, Hz) 2,14 (1H; dd; 13,5; 6,5; H-3’a); 2,47 (1H; dd; 13,5; 6,5; H-3’b); 3,62 (1H; m; H-6’a); 3,69 (1H; dd; 11,5; 4,5; H-6’b); 4,03 (1H; dt; 6,5; 4,5; H-5’); 4,18 (1H; d; 14,0; H-1’a); 4,47 (1H; q; 6,5; H-4’); 4,67 (1H; dd; 14,0; 1,0; H-1’b); 4,80 (1H; d; 15,5; H-6a); 5,07 (1H; dd; 15,5; 1,0; H-6b); 6,02 (1H; d; 4,0; H-4); 6,97 (1H; d; 4,0; H-3); 9,47 (1H; s; 2-CHO). C NMR (125 MHz, acetone-d): δ 179,1 (C-7); 136,0 (C-5); 132,3 (C-2); 124,3 (C-3); 105,2 (C-4); 103,8 (C-2’); 89,9 (C-5’); 72,0 (C-4’); 64,0 (C-6’); 58,9 (C-6); 52,8 (C-1’); 45,9 (C-3’).

Shensongine A (3): HRESIMS: m/z 276,0854 [M+Na] (CHNONa, 276,0842); H NMR (500 MHz, acetone-d): δ (J, Hz) 1,91 (1H; dd; 12,5; 5,0; H-3’a); 1,98 (1H; dd; 12,5; 11,5; H-3’b); 3,78 (2H; m; H-4’); 3,80 (1H; m; H-6’); 3,95 (1H; d; 14,0; H-1’a); 4,08 (1H; m; H-5’); 4,18 (1H; d; 14,0; H-1’a); 4,55 (1H; d; 14,0; H-1’b); 4,74 (1H; d; 15,5; H-6a); 4,85 (1H; d; 15,5; H-6b); 6,04 (1H; d; 4,0; H-4); 6,96 (1H; d; 4,0; H-3); 9,46 (1H; s; 2-CHO). C NMR (125 MHz, acetone-d): δ 179,1 (C-7); 135,5 (C-5); 132,3 (C-2); 124,3 (C-3); 105,4 (C-4); 96,3 (C-2’); 68,2 (C-4’); 66,0 (C-6’); 65,6 (C-5’); 58,2 (C-6); 53,2 (C-1’); 36,4 (C-3’). HR-ESI-MS [M+Na]m/z là 276.0854.

5-Methoxymethyl-1H-pyrrole-2-carbaldehyde (4): HRESIMS: m/z 162.0535 [M+Na] (CHNONa, 162,0525); H NMR (500 MHz, acetone-d): δ (J, Hz) 3,31 (3H; s; 6-OCH); 4,47 (2H; s; H-6); 6,27 (1H; dd; 4,0; 2,5; H-4); 6,94 (1H; dd; 4,0; 2,5; H-3); 9,50 (1H; s; 2-CHO). C NMR (125 MHz, acetone-d): δ 179,3 (C-7); 138,6 (C-5); 134,0 (C-2); 121,1 (C-3); 110,9 (C-4); 67,1 (C-6); 57,9 (6-OCH).

1-[2-(Furan-2-yl)-2-oxoethyl]pyrrolidin-2-one (5): HRESIMS: m/z 194.0820 [M+H] (CHNO, 194,0812); H NMR (500 MHz, acetone-d): δ (J, Hz) 2,09 (2H; p; 2,5; H-11); 2,33 (2H; t; 8,0; H-10); 3,52 (2H; t; 7,0; H-12); 4,60 (2H; s; H-7); 6,72 (1H; dd; 3,5; 2,0; H-4); 7,45 (1H; dd; 3,5; 0,8; H-3); 7,89 (1H; dd; 2,0; 0,8; H-5). C NMR (125 MHz, acetone-d): δ 184,0 (C-6); 175,6 (C-9); 152,3 (C-2); 148,3 (C-5); 118,7 (C-3); 113,3 (C-4); 49,2 (C-7); 48,4 (C-12); 30,8 (C-10); 18,9 (C-11).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hợp chất 1 được phân lập dưới dạng vô định hình. Phổ HRESIMS cho thấy tín hiệu của mũi ion phân tử giả tại m/z là 276,0854 [M+Na], dự đoán công thức phân tử của hợp chất 1 là CHNO. Phổ H NMR của hợp chất 1 cho thấy 2 tín hiệu tương ứng với 2 proton olefin chẻ mũi đôi, cộng hưởng tại [δ 6,05 (d; 4,0 Hz; H-4); 6,98 (d; 4,0 Hz; H-3)], chứng tỏ hợp chất 1 mang khung pyrrole với 3 nhóm thế tại vị trí 1, 2, 5. Ngoài ra, trên phổ H NMR có xuất hiện các tín hiệu của một nhóm formyl [δ 9,46 (s; H-7)], một nhóm oxymethylene [δ4,84 (d; 15,5 Hz; H-6a); 4,99 (d; 15,5 Hz; H-6b)]. Bên cạnh đó, phổ H NMR của hợp chất 1 còn cho thấy các tín hiệu proton tương ứng với sự hiện diện của nhóm đường: hai nhóm methylene [δ 4,19 (d; 14,0 Hz; H-1’a); 4,53 (d; 14,0 Hz; H-1’b);2,14 (dd; 14,0; 3,0 Hz; H-3’a); 2,39 (dd; 14,0; 8,0 Hz; H-3’b)], một nhóm oxymethylene [δ3,61 (m; H-6’a); 3,69 (dd; 12,0; 4,2 Hz; H-6’b) và hai nhóm oxymethine [δ 4,35 (brs; H-4’); 4,10 (q; 4,2 Hz; H-5’)]. Phổ C NMR của hợp chất 1 hiện diện tín hiệu của 12 carbon bao gồm một carbon carbonyl (δ 179,1); bốn carbon olefin (δ 136,0; 132,3; 124,3; 105,4); 5 carbon mang oxygen (δ 104,2; 89,6; 72,3; 62,9; 58,4) và hai carbon methylene (δ 51,8; 45,4). Hơn nữa, sự hiện diện của khung pyrrole mang 3 nhóm thế tại vị trí 1,2,5 được xác nhận thông qua tương quan HMBC giữa proton H-1’ với carbon C-5, giữa proton H-3 với carbon C-2, giữa proton H-4 với carbon C-5, C-6. Các tương quan HMBC (Figure 2) giữa proton H-3 với carbon C-2, C-7, giữa proton H-4 với carbon C-5, C-6, và proton H-6 với carbon C-4, C-5 chứng minh sự hiện diện của mảnh 5-oxymethyl-2-formylpyrrole tồn tại trong hợp chất 1. Ngoài ra, tương quan HMBC (Figure 2) thể hiện nhóm đường có thể tồn tại dưới 2 dạng là 3’-deoxyfructopyranose và 3’-deoxyfructofuranose. Tuy nhiên, so sánh tài liệu tham khảo14 với dữ liệu phổ H và C NMR của phân tử đường xác định phân tử đường tồn tại dưới dạng 3’-deoxyfructofuranose. Cấu hình tương đối của proton H-4’ và H-5’ được xác định dựa trên sự phân tích hằng số ghép của J. Nếu J > 9,0 Hz, hai proton này có cấu hình cis, và ngược lại, chúng tồn tại ở cấu hình trans [11]. Mặt khác, J của hợp chất 1 là 3.5 Hz, vì thế, hai proton H-4’ và H-5’ có cấu hình trans. Ngoài ra, tương quan HMBC (Figure 2) giữa proton H-1’ với C-2’, C-5 và giữa proton H-6 với carbon C-2’, C-5, C-4, điều này chứng tỏ sự hiện diện của vòng oxazine liên kết mảnh 5-oxymethyl-2-formylpyrrole với đường 3’-deoxyfructofuranose. Hơn nữa, cấu hình tuyệt đối của carbon C-2’ được xác định dựa trên năng lực truyền quang với giá trị [α] +286,5 (MeOH, c 5,15×10), vì vậy, cấu hình tuyệt đối tại carbon C-2’ được xác định là 2’R.15 Từ dữ liệu phổ 1D và 2D NMR, kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo 12, cấu trúc hóa học của hợp chất 1 được xác định là pollenopyrroside B, tên gọi khác là acortatarin A.

Hợp chất 2 tồn tại dưới dạng vô định hình. Phổ HRESIMS cho thấy tín hiệu của mũi ion phân tử giả tại m/z 254,1035 [M+H], ứng với công thức phân tử CHNO. Phổ H và C NMR của hợp chất 2 tương tự với dữ liệu phổ hợp chất 1, tuy nhiên thể hiện một số khác biệt về độ dịch chuyển hóa học. Đặc biệt, năng lực truyền quang của hợp chất 2 có giá trị [α] −168,0 (MeOH, c 2,0×10), kết hợp so sánh tài liệu tham khảo cho thấy carbon C-2’ trong hợp chất 2 có cấu hình 2’S. Từ các dữ liệu phân tích trên, cấu trúc hóa học của hợp chất 2 được xác định là epi-acortatarin A 16.

Hợp chất 3 được phân lập dưới dạng vô định hình. Phổ HRESIMS cho thấy tín hiệu của mũi ion phân tử giả tại m/z 276,0854 [M+Na], ứng với công thức phân tử CHNO. Phổ H và C NMR của hợp chất 3 tương tự dữ liệu phổ của hợp chất 1, điều này có nghĩa là trong hợp chất 3 có sự hiện hiện của vòng oxarine liên kết giữa mảnh 5-oxymethyl-2-formylpyrrole với một phân tử đường. Tuy nhiên, trong hợp chất 3, có sự khác biệt nhiều về độ dịch chuyển hóa học của các tín hiệu carbon của nhóm đường, cụ thể C-1’ tại 53,2 ppm (Dδ = +1,4 ppm), C-2’ tại 96,3 ppm (Dδ = −7,9 ppm), C-3’ tại 36,4 ppm (Dδ = +9,0 ppm), C-4’ tại 68,2 ppm (Dδ = −4,1 ppm), C-5’ tại 65,6 (Dδ = −24,0 ppm), và C-6’ tại 66,0 ppm (Dδ = +3,1 ppm), điều này chứng tỏ sự thay đổi dạng vòng của phân tử đường, từ dạng vòng furano/pyrano-dioxaspiro thành dạng vòng pyrano/pyrano-dioxaspiro. Bên cạnh đó, tương quan HMBC giữa proton H-1’ với carbon C-6’, C-2’, C-5, và proton H-6’ với carbon C-2’, C-4’, điều này chứng tỏ nhóm đường tồn tại dưới dạng 3’-deoxyfructopyranose. Cấu hình tương đối của 2 proton H-4’ và H-5’ có thể ở vị trí trans- hay cis, bằng cách so sánh tài liệu tham khảo17 kết hợp với dữ liệu phổ H and C NMR cho thấy mảnh 3’-deoxyfructopyranose trong hợp chất 3 tồn tại dưới dạng cis-3’-deoxyfructopyranose. Dựa trên năng lực truyền quang [α] −205,0 (MeOH, c 2,50×10) và so sánh với tài liệu tham khảo, cấu hình tuyệt đối của carbon C-2’ được xác định là 2’S16. Cuối cùng, cấu trúc hóa học của hợp chất 3 là shensongine A 18.

Hợp chất 4 được phân lập dưới dạng vô định hình. Phổ HRESIMS cho thấy tín hiệu của mũi ion phân tử giả tại m/z 162,0535 [M+Na], giúp xác định công thức phân tử của hợp chất 4 là CHNO. Phổ H NMR của hợp chất 4 cho thấy sự hiện diện của hai proton olefin [δ6,27 (1H; dd; 4,0; 2,5 Hz; H-4); 6,94 (1H; dd; 4,0; 2,5 Hz; H-3)], điều này chứng tỏ sự có mặt của khung pyrrole mang 2 nhóm thế tại 2,5. Ngoài ra, phổ H NMR cho thấy các tín hiệu của một nhóm formyl [δ9,50 (1H; s; 2-CHO)], một nhóm oxymethylene [δ4,47 (2H; s; H-6)] và một nhóm methoxy [δ 3,31 (3H; s; 6-OCH)]. Phổ C NMR của hợp chất 4 hiện diện tín hiệu của 7 carbon bao gồm một carbon carbonyl [δ 179,3 (C-7)], bốn carbon olefin [δ138,6 (C-5); 134,0 (C-2); 121,1 (C-3); 110,9 (C-4)], một carbon oxymethylene [δ 67,1 (C-6)] và một carbon methoxy [δ 57,9 (6-OCH)]. Dựa trên hình dạng tín hiệu của proton nhóm methoxy (δ 3,31; s) và nhóm methylene (δ4,47; s) cho thấy nhóm gắn trực tiếp vào mảnh 5-oxymethyl-2-formylpyrrole thông qua cầu nối ether. Bằng cách so sánh với tài liệu tham khảo19, cấu trúc của hợp chất 4 được đề nghị là 5-methoxymethyl-1H-pyrrole-2-carbaldehyde.

Hợp chất 5 được phân lập dưới dạng vô định hình. Phổ HRESIMS cho thấy tín hiệu của mũi ion phân tử giả tại m/z 194,0820 [M+H], ứng với công thức phân tử CHNO. Phổ H NMR của hợp chất 5thể hiện tín hiệu của ba proton olefin [δ 6,72 (dd; 3,5; 2,0 Hz; H-4); 7,45 (dd; 3,5; 0,8 Hz; H-3); 7,89 (dd; 2,0; 0,8 Hz; H-5)], điều này cho thấy hợp chất 5 mang khung furan 1 nhóm thế. Bên cạnh đó, phổ H NMR của hợp chất 5còn có các tín hiệu của bốn proton methylene [δ 2,09 (d; 2,5 Hz; H-11); 2,33 (t; 8,0; H-10); 3,52 (t; 7,0; H-12); 4,60 (s; H-7)]. Phổ C NMR của hợp chất 5hiện diện tín hiệu của 10 carbon bao gồm hai carbon carbonyl (δ 184,0; 175,6); hai carbon olefin mang oxygen (δ 152,3; 148,3); hai carbon olefin (δ 118,7; 113,3); và bốn carbon methylene (δ 18,9–49,2). Hơn nữa, sự hiện diện của hai nhóm methylene cộng hưởng tại 3–4 ppm trong phổ H NMR cùng với tương quan HMBC giữa proton H-7 với carbon C-12, điều này chứng minh rằng hai nhóm methylene cùng gắn với một nguyên tử N. Hơn thế, tương quan HMBC giữa proton H-7 với carbon C-9, proton H-12 với carbon C-9, C-11, proton H-11 với carbon C-9,C-12, và proton H-10 với C-9, C-11, C-12, điều này chỉ ra sự có mặt của mảnh N-methyl-g-lactame tồn tại trong hợp chất 5. Ngoài ra, mảnh N-methyl-g-lactame này liên kết với vòng furan mang 1 nhóm thể thông qua cầu nối ketone, điều này được quan sát bởi tương quan HMBC giữa proton H-7 với carbon C-6, C-2. Từ các phân tích trên và kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo 20, cấu trúc hóa học của hợp chất 5 được đề nghị là 1-[2-(furan-2-yl)-2-oxoethyl]pyrrolidin-2-one.

KẾT LUẬN

Từ cao CHCl của hoa cây Bồng bồng (Calotropis gigantea) đã phân lập được 5 hợp chất là pollenopyrroside B (1), epi-acortatarin A (2), shensongine A (3), 5-methoxymethyl-1H-pyrrole-2-carbaldehyde (4), 1-[2-(furan-2-yl)-2-oxoethyl]pyrrolidin-2-one (5). Tất cả 5 hợp chất trên lần đầu được tìm thấy trong hoa của cây Bồng bồng.

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu được tài trợ bởi Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) mã số đề tài 104.01-2019.351.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1D NMR: One-dimensional nuclear magnetic resonance

2D NMR: Two-dimensional nuclear magnetic resonance

CHCl: Chloroform

d: Doublet

dd: Doublet of doublets

EtOAc: Ethyl acetate

HMBC: Heteronuclear multiple bond coherence

HSQC: Heteronuclear single quantum coherence

m: Multiplet

MeOH: methanol

t: Triplet

TMS: Tetramethylsilane

s: Singlet

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Các tác giả cam đoan không có bất kỳ xung đột lợi ích nào trong bài nghiên cứu này.

ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ

Trần Hoài Tú, Đặng Hoàng Phú, Lê Hữu Thọ thu thập mẫu cây, thực hiện thí nghiệm, xử lý các dữ liệu phổ và viết bản thảo. Đỗ Văn Nhật Trường, Nguyễn Xuân Hải hỗ trợ xử lý các dữ liệu phổ. Nguyễn Thị Thanh Mai định hướng, lên kế hoạch nghiên cứu. Nguyễn Trung Nhân góp phần thảo luận các kết quả nghiên cứu và hoàn chỉnh bản thảo.