MỞ ĐẦU

Cây Kiến cò có tên khoa học là Rhinacanthus nasutus là một cây thuộc Họ Ô rô (Acanthaceae). Các bộ phận khác nhau của cây đã được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh như eczema, bệnh lao phổi, herpes, viêm gan, đái tháo đường, tăng huyết áp và một số bệnh về da.1, 2 Trong một số thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các dịch chiết của cây cho thấy cây Kiến cò có tác dụng tiềm năng để điều trị một số bệnh như điều trị ung thư, rối loạn chức năng của gan, bệnh ngoài da, loét dạ dày tá tràng, giun sán, bệnh ghẻ, viêm và béo phì.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Kiến cò cho thấy trong cây có các hợp chất naphthoquinone, anthraquinone, lignan, flavonoid, phenol, triterpenoid và sterol…,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 các nghiên cứu cũng cho thấy cây Kiến cò có hoạt tính kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng tiểu cầu…8, 13, 15, 16

Ở Việt Nam, cho đến nay chỉ mới tìm thấy một nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Kiến cò4 và hầu như chưa có nghiên cứu nào về hoạt tính sinh học. Do các nghiên cứu về cây Kiến cò còn rất ít và hạn chế, vì vậy việc tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên loài cây này sẽ giúp định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng sâu hơn và có thể sử dụng loài dược liệu này hiệu quả hơn. Bằng các phương pháp sắc ký cột pha thường kết hợp với các phương pháp phổ nghiệm hiện đại, chúng tôi đã phân lập được 7 hợp chất từ cao EtOAc của cây Kiến cò là umbelliferone (1), kimmin (2), sinensetin (3), kaempferol (4), quercetin (5), rutin (6) và daucosterol (7).

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Chiết xuất và phân lập

Xay nhỏ 3 kg mẫu lá cây Kiến cò, sau đó tiến hành đun hoàn lưu với dung môi MeOH, thu hồi dung môi bằng hệ thống cô quay chân không thu được cao thô MeOH (300,0 g). Cao MeOH được phân tán vào nước và chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexane, EtOAc và n-BuOH. Tiến hành cô quay chân không các dịch chiết xuất thu được các cao tương ứng là cao n-hexane (50 g), cao EtOAc (50 g) và cao n-BuOH (92 g).

Tiến hành sắc ký lớp mỏng với các cao thô, kết hợp với khả năng hấp thu tia tử ngoại và hiện vết bằng thuốc thử HSO 20% cho thấy cao EtOAc tách tốt nhất nên được chọn để tiếp tục tiến hành điều chế cao phân đoạn. Cao EtOAc (50 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi giải ly là -hexane:EtOAc từ 0-100% EtOAc, sau đó tiếp đến hệ EtOAc:MeOH (1:1). Dung dịch từ cột sắc ký được hứng bằng erlen 1000 mL, cô quay chân không và tiến hành sắc ký lớp mỏng. Dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng gom thành tám cao phân đoạn ký hiệu lần lượt là A (3,5 g), B (2,4 g), C (3,8 g), D (2,9 g), E (3,3 g), F (2,5 g), G (2,5 g), H (3,9 g). Từ các phân đoạn A, B, G, H tiến hành sắc ký cột, kết hợp sắc kí lớp mỏng điều chế pha thường nhiều lần với các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau thu được bảy hợp chất là umbelliferone (1), kimmin (2), sinensetin (3), kaempferol (4), quercetin (5), rutin (6) và daucosterol (7) (Figure 1).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hợp chất 1 có dạng bột màu vàng trắng, tan tốt trong dung môi acetone. Phổ H-NMR của hợp chất 1 cho thấy có các tín hiệu cộng hưởng của ba proton thơm ghép hệ ABX (δ 6,75; d; J = 2,3 Hz; H-8), (δ 6,84; dd; J = 8,5 và 2,3 Hz; H-6) và (δ 7,50; d; J = 8,5 Hz, H-5); hai proton olefin ghép cis với nhau (δ 6,16; d; J = 9,5 Hz; H-3) và (δ 7,85; d; J = 9,5 Hz; H-4). Phổ C-NMR của hợp chất 1 có chín carbon, trong đó có một carbon carbonyl của nhóm ester (δ 162,1; C-2); hai carbon thơm tứ cấp gắn với oxy [δ 161,1; C-7] và [δ 157,0; C-9]; một carbon thơm tứ cấp mang nhóm thế (δ 112,9; C-10); ba carbon methine thơm (δ 130,5; C-5), (δ 113,8; C-6) và (δ 103,5; C-8); cùng với hai carbon olefin tam cấp (δ 113,8, C-3) và (δ 144,7; C-4) (Table 1). Từ các dữ liệu phổ này cho thấy hợp chất 1 có cấu trúc của một coumarin, kết hợp với tra cứu tài liệu tham khảo17 cho phép xác nhận hợp chất 1 là umbelliferone.

Hợp chất 2 có dạng bột màu trắng, tan tốt trong dung môi MeOH. Phổ H-NMR của hợp chất 2 cho thấy có các tín hiệu cộng hưởng của một coumarin tương tự như umbelliferone (1), ngoài trừ có sự xuất hiện thêm các tín hiệu đặc trưng của một đơn vị đường glucose (δ 5,06; d; 7.6; H-1′), (δ 3,93 dd; 12,1 và 2,3 Hz; H-6′a), (δ 3,73 dd; 12,1 và 5,8 Hz; H-6′b), (δ 3,50 – 3,56 m; H-2′; H-3′; H-5′) và (δ 3,42; m; H-4′). Tương tự, phổ C-NMR của hợp chất 3 cũng xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của umbelliferone (1) và có sự xuất hiện thêm các tín hiệu của một đơn vị đường glucose (δ 100,5; C-1′), (δ 77,0; C-2′), (δ 76,5; C-3′), (δ 73,4; C-5′), (δ 69,9; C-4′) và (δ 61,0; C-6′) (Table 1). Mặt khác, phổ HMBC của hợp chất 2 cho thấy sự tương quan giữa proton H-1’ với C-7, chứng tỏ đơn vị đường glucose sẽ gắn vào khung umbelliferone tại vị trí C-7. Ngoài ra, phổ HMBC cũng cho thấy sự tương quan của các proton H-3; H-4; H-5; H-6; H-8 đến C-10, tương quan của H-4; H-5; H-6; H-8 đến C-9, tương quan của H-3; H-4 đến C-2, tương quan của H-5 và H-8 đến C-7 giúp khẳng định các vị trí proton và carbon trên phần anlycon. Phổ COSY và HSQC của hợp chất 2 cũng cho thấy sự tương quan của các proton kế cận và giữ các proton và carbon tương ứng (Figure 2). Từ các dữ liệu phổ này cho thấy hợp chất 2 có cấu trúc của umbelliferone (1) gắn với một đơn vị đường glucose, kết hợp với tra cứu tài liệu tham khảo18 cho phép xác nhận hợp chất 2 là skimmin.

Hợp chất 3 có dạng bột màu vàng, tan tốt trong dung môi CHCl. Phổ H-NMR của hợp chất 3 cho thấy có các tín hiệu cộng hưởng của của ba proton thơm ghép hệ ABX ( 7,51; 1H; dd; J = 8,5 và 2,0 Hz; H-6′), 6,97 (d, J = 8,5 Hz, H-5′), ( 7,33 d; J = 2,0 Hz; H-2′), một proton thơm cô lập ( 6,80; 1H; s; H-8) và một proton olefin cô lập ( 6,60; 1H; s; H-3). Cùng với năm tín hiệu cộng hưởng của năm nhóm methoxyl ( 3,99; s; 5-OCH), ( 3,92; s; 6-OCH), ( 3,98; s; 7-OCH), ( 3,99; s; 3′-OCH), ( 3,96; s; 4′-OCH). Phổ C-NMR cho thấy hợp chất 3 có sự xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 20 carbon, trong đó có một carbon carbonyl nhóm ketone ( 177,3; C-4); sáu carbon thơm gắn oxy (157,8; C-7), (154,6; C-5), ( 152,7; C-9), ( 152,0; C-4′), ( 149,5; C-3′) và ( 140,5; C-6); một carbon olefin gắn oxy ( 161,3; C-2); hai carbon thơm mang nhóm thế ở (124,3; C-1′) và ( 113,0; C-10); bốn carbon methin thơm ở (119,7; C-6′), ( 111,3; C-5′), ( 108,9; C-2′), và ( 96,4; C-8); một carbon methine olefin ( 107,6; C-3). Cùng với năm carbon methoxyl ( 62,3; 5-OCH), ( 61,7; 6-OCH), ( 56,5; 7-OCH), ( 56,3; 3′-OCH) và ( 56,2; 4′-OCH) (Table 2). Tiến hành so sánh dữ liệu phổ của hợp chất 3 và tài liệu tham khảo của hợp chất sinensetin19 cho thấy có sự tương đồng. Vậy hợp chất 3 được đề nghị là sinensetin.

Hợp chất 4 có dạng bột màu vàng, tan tốt trong dung môi acetone. Phổ H-NMR của hợp chất 4 cho thấy có các tín hiệu cộng hưởng của của hai proton ghép meta ( 6,26; d, J=1,8 Hz, H-6) và ( 6,53 d, J=1,8 Hz, H-8); hai cặp proton thơm ghép ortho ( 8,14; d, J=8,7 Hz, H-2′,6′) và 7,01 (2H, d, J=8,7 Hz, H-3′,5′); cùng với tín hiệu của một nhóm hydroxyl kiềm nối ( 12,16; 5-OH). Phổ C-NMR cho thấy hợp chất 3 có sự xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 15 carbon, trong đó có 1 carbon carbonyl nhóm ketone ( 176,8; C-4); bốn carbon thơm gắn oxy (165,1; C-7), (162,4; C-5), ( 157,9; C-9), ( 147,2; C-4′); hai carbon olefin gắn oxy ( 160,2; C-2) và ( 136,7; C-3); hai carbon thơm mang nhóm thế ở (123,4; C-1′) và ( 104,3; C-10); sáu carbon methine thơm ở (130,6; C-2′,6′), ( 116,4; C-3′,5′), ( 99,3; C-6), và ( 94,6; C-8) (Table 3). Tiến hành so sánh dữ liệu phổ của hợp chất 4 và tài liệu tham khảo của hợp chất kaempferol thấy có sự tương đồng. Vậy hợp chất 4 được đề nghị là kaempferol.

Hợp chất 5 có dạng bột màu vàng, tan tốt trong dung môi acetone. Phổ H-NMR của hợp chất 5 cho thấy có các tín hiệu cộng hưởng của của hai proton ghép meta ( 6,22; d, J=2,0 Hz, H-6) và ( 6,48 d, J=2,0 Hz, H-8); ba proton thơm ghép hệ ABX ( 6,96; d, J=8,0 Hz, H-5′) và ( 7,66 d, J=8,0 và 2,0 Hz, H-5′), ( 7,79 d, J=2,0 Hz, H-2′); cùng với tín hiệu của một nhóm hydroxyl kiềm nối ( 12,15; 5-OH). Phổ C-NMR cho thấy hợp chất 3 có sự xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 15 carbon, trong đó có một carbon carbonyl nhóm ketone ( 176,4; C-4); năm carbon thơm gắn oxy (164,9; C-7), (162,0; C-5), ( 157,7; C-9), ( 148,2; C-4′), ( 145,7; C-3′); hai carbon olefin gắn oxy ( 146,8; C-2) và ( 136,6; C-3); hai carbon thơm mang nhóm thế ở (123,5; C-1′) và ( 104,0; C-10); năm carbon methine thơm ở (121,4; C-6′), ( 115,6; C-2′), ( 116,1; C-5′), ( 98,9; C-6), và ( 94,4; C-8) (Table 3). Tiến hành so sánh dữ liệu phổ của hợp chất 5 với kết hợp với tra cứu tài liệu tham khảo của quercetin20 thấy có sự tương đồng. Vậy hợp chất 5 được đề nghị là quercetin.

Hợp chất 6 có dạng bột màu vàng, tan tốt trong dung môi DMSO. Phổ H-NMR của hợp chất 6 cho thấy có các tín hiệu cộng hưởng của một flavonoid tương tự như quercetin (5), ngoài trừ có sự xuất hiện thêm các tín hiệu đặc trưng của hai đơn vị đường 5,32 (d, 7,35 Hz, H-1′′) 4,36 (brs, H-1′′′) 3,85 (dd, 11,8 2,2 Hz, H-6′′a) 3,63 (dd, 11,9 6,2 Hz, H-6′′b) 3,33 – 3,69 (overlap, H-2′′, H-3′′, H-4′′, H-5′′, H-2′′′, H-3′′′, H-4′′′, H-5′′′) 0,97 (d, 6,2 Hz, H-6′′′). Hai proton tại 5,32 (d, 7,35 Hz, H-1′′) và 4,36 (brs, H-1′′′) lần lượt xác nhận là proton anomer của đơn vị đường β-glycosyl và α-rhamnosyl. Tương tự, phổ C-NMR của hợp chất 6 cũng xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của quercetin (5) và có sự xuất hiện thêm các tín hiệu của hai đơn vị đường 101,6 (C-1′′) 101,2 (C-1′′′) 76,9 (C-3′′) 76,4 (C-5′′) 74,5 (C-2′′) 72,3 (C-4′′′) 71,0 (C-3′′′) 70,8 (C-2′′′) 70,5 (C-4′′) 68,7 (C-5′′′) 67,4 (C-6′′) và 18,1 (C-6′′′) (Table 4). Phổ HMBC cho thấy có sự tương quan từ proton ở 4,36 (brs, H-1′′′) đến C-6′′ và từ proton anomer của đường glucose đến carbon tứ cấp tại δ 133,3 ppm giúp xác nhận phần đường gắn vào vị trí C-3. Từ các dữ liệu phổ này cho thấy hợp chất 6 có cấu trúc của quercetin (5) gắn với một đơn vị đường glucose và một đơn vị đường rhamnose, kết hợp với tra cứu tài liệu tham khảo21 cho phép xác nhận hợp chất 6 là rutin.

Hợp chất 7có dạng bột, màu trắng, tan tốt trong hỗn hợp dung môi chloroform và methanol. Phổ H-NMR của hợp chất 7 cho thấy ở vùng trường thấp có sự xuất hiện tín hiệu của một proton olefin [δ 5,31 (1H; s; H-6)] và một proton anomer của glucoside [δ 4,35 (1H; d; J = 9,4 Hz; H-1')]. Ở vùng trường cao cho thấy có sự xuất hiện tín hiệu của năm nhóm oxymethine [δ 3,54 (1H; m; H-3)], [δ 3,23 (1H; s; H-2')], [δ 3,38 (1H; m; H-3')], [δ 3,39 (1H; m; H-4')], [δ 3,30 (1H; s; H-5')]; một nhóm oxymethylene [δ 3,68 (1H; d; J = 10,3 Hz; H-6')], [δ 3,70 (1H; d; J = 10,3 Hz; H-6') sáu nhóm methyl [δ 0,75 (3H; s; H-18)], [δ 0,80 (3H; s; H-19)], [δ 0,96 (3H; d; J = 1,7 Hz; H-21)], [δ 0,87 (3H; d; J = 6,6 Hz; H-26)], [δ 0,80 (3H; s; H-27)], [δ 0,87 (3H; d; J = 6,6 Hz; H-29)]. Ngoài ra ở vùng trường cao còn có sự xuất hiện của nhiều nhóm methine và methylene nằm trong vùng có độ dịch chuyển hóa học từ 1,00 ppm đến 2,00 ppm. Phổ C-NMR cho thấy hợp chất 7 có xuất hiện tín hiệu của 35 carbon. Trong đó, ở vùng từ trường thấp có sự xuất hiện của một carbon olefin tứ cấp [δ 140,3; C-5]; một carbon olefin tam cấp [δ 122,0; C-6]; một carbon nhóm anomer của glucoside [δ 101,1; C-1']; năm carbon nhóm oxymethine [δ 79,1; C-3], [δ 73,5; C-2'], [δ 76,4; C-3'], [δ 70,2; C-4'], [δ 75,7; C-5']; một carbon nhóm oxymethylene [δ 61,8; C-6']. Ở vùng trường cao có sự xuất hiện tín hiệu của hai carbon sp tứ cấp [δ 36,6; C-10], [δ 42,3; C-13]; bảy carbon nhóm methine [δ 31,8; C-8], [δ 50,2; C-9], [δ 56,7; C-14], [δ 56,0; C-17], [δ 36,1; C-20], [δ 45,9; C-24], [δ 29,2; C-25]; 11 carbon nhóm methylene [δ 37,2; C-1], [δ 29,5; C-2], [δ 38,6; C-4], [δ 31,8; C-7], [δ 21,0; C-11], [δ 39,7; C-12], [δ 24,2; C-15], [δ 28,1; C-16], [δ 33,9; C-22], [δ 26,1; C-23], [δ 23,0; C-28]; sáu carbon nhóm methyl [δ 11,7; C-18], [δ 19,1; C-19], [δ 18,6; C-21], [δ 19,6; C-26], [δ 18,9; C-27], [δ 11,8; C-29] (Table 5). Từ dữ liệu phổ trên cho thấy hợp chất 7 có cấu trúc của một steroid khung stigmastane gắn với một đơn vị đường glucose. Tiến hành so sánh dữ liệu phổ của hợp chất 7 với hợp chất daucosterol22 cho thấy sự tương đồng. Vậy hợp chất 7 là daucosterol.

KẾT LUẬN

Từ 3,0 kg bột lá cây Kiến cò đã điều chế được các cao thô cao n-hexane (50,0 g), cao EtOAc (50 g) và cao n-BuOH (92,0 g). Bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng nhiều lần đã phân lập được bảy hợp chất từ cao EtOAc của lá cây Kiến cò là umbelliferone (1), kimmin (2), sinensetin (3), kaempferol (4), quercetin (5), rutin (6) và daucosterol (7). Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định dựa vào phổ NMR kết hợp so sánh tài liệu tham khảo. Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất kimmin (2), sinensetin (3), kaempferol (4), quercetin (5) thuộc khung flavonoid và coumarin lần đầu tiên được tìm thấy trong loài này.

Lời cảm ơn

Nghiên cứu được tài trợ bởi Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, ĐHQG-HCM trong khuôn khổ Đề tài mã số HH 2021-16.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của H.

C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của C.

EtOAc: Ethyl acetate

MeOH: Methanol

n-BuOH: Butanol

s: Mũi đơn (singlet)

d: Mũi đôi (doublet)

m: Mũi đa (multilet)

brs: Mũi đơn bầu rộng (broad singlet)

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Các tác giả cam đoan không có bất kỳ xung đột lợi ích nào trong bài nghiên cứu này.

ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ

Huỳnh Thanh Nam phân lập các hợp chất. Huỳnh Thanh Nam và Nguyễn Thị Ý Nhi phân tích cấu trúc các hợp chất. Huỳnh Thanh Nam và Đỗ Văn Nhật Trường viết bản thảo bài báo. Nguyễn Thị Ý Nhi và Trần Lê Quan phân bố cục và chỉnh sửa bản thảo chi tiết. Tất cả các tác giả đã đọc và chấp nhận bản thảo cuối cùng.