Đối tượng nghiên cứu

Thân cây Dủ dẻ trâu được thu hái tại huyện Di Linh, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam vào tháng 7 năm 2017. Cây được định danh khoa học bởi Tiến sĩ Đặng Văn Sơn, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tiêu bản thực vật với mã số US-A012, được lưu giữ tại Bộ môn Hoá hữu cơ, Khoa Hoá, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh. Sau khi thu hái, mẫu được rửa sạch, phơi khô, nghiền thành bột, ngâm chiết với ethanol 95% ở 30 C.

Hóa chất và thiết bị

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đo trên máy Bruker Avance 500 III (500 MHz cho phổ H–NMR và 125 MHz cho phổ C–NMR) và Bruker 600 AvanceNEO (600 MHz cho phổ H–NMR và 150 MHz cho phổ C–NMR), đặt tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Phổ ESIMS được đo trên máy Bruker microOTOF Q-II, đặt tại Phòng Nghiên cứu và Phát triển Hóa dược, Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 01 đường Thạnh Lộc 29, Quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh. Sắc kí cột (SKC) sử dụng silica gel 60 (0,040–0,063 mm, Merck), silica gel RP–18 (Merck) và Sephadex LH–20 (GE Healthcare). Sắc kí lớp mỏng sử dụng bản mỏng silica gel F, silica gel 60 RP–18 F(Merck), thuốc thử hiện vết là dung dịch acid sulfuric 10%, gia nhiệt. Các hóa chất sử dụng cho quá trình chiết và sắc kí là ethanol (EtOH), methanol (MeOH), n–hexane, chloroform (CHCl), ethyl acetate (EtOAc) và acetone (được cung cấp bởi hãng Chemsol).

Chiết xuất và phân lập

Bột thân cây khô (45,0 kg) được trích bằng dung môi ethanol 95% ở nhiệt độ 30 C. Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao ethanol thô (1,3 kg). Từ cao thô ethanol, thực hiện việc chiết lỏng‒lỏng lần lượt với các dung môi n-hexane, ethyl acetate, đuổi dung môi phần dịch chiết, thu được các cao thành phần tương ứng: cao n-hexane (45,0 g), cao ethyl acetate (161,0 g) và dịch chiết còn lại. Cao ethyl acetate (161,0 g) được sắc kí cột silica gel pha thường, với hệ dung môi giải ly là n-hexane: ethyl acetate (85:15; 80:20; 70:30; 50:50; 0:100, v/v), và hệ dung môi ethyl acetate: methanol (90:10; 70:30; 50:50; 0:100, v/v). Căn cứ vào kết quả sắc ký lớp mỏng, cao ethyl acetate được phân chia làm 13 phân đoạn (EA.1–EA.13).

Phân đoạn EA.3 (21,0 g) được thực hiện sắc ký cột và giải ly bằng n-hexane: ethyl acetate có độ phân cực tăng dần (85:15; 0:100, v/v), thu được bảy phân đoạn (EA.3.1–EA.3.7). Sắc kí cột silica gel pha thường trên phân đoạn EA.3.2 (2,2 g) với hệ dung môi giải ly là n-hexane: ethyl acetate (80:20, v/v), tiếp theo sắc ký gel Sephadex LH-20 giải ly với hệ CHCl: MeOH (1:4, v/v) phân lập được hai hợp chất 2 (7,0 mg) và 3 (6,2 mg). Hợp chất 1 (5,5 mg) được phân lập từ phân đoạn EA.3.4 (3,2 g) bằng sắc ký cột silica gel giải ly n-hexane: ethyl acetate (65:35, v/v)

Phân đoạn EA.4 (3,0 g) được thực hiện sắc ký cột giải ly với n-hexane: ethyl acetate (85:15; 0:100, v/v), thu được bốn phân đoạn (EA.4.1–EA.4.4). Trên phân đoạn EA.4.2 (0,8 g), áp dụng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ giải ly CHCl: MeOH (95:5, v/v) tiếp theo sắc ký cột gel Sephadex LH-20 giải ly với hệ dung môi CHCl: MeOH (1:4, v/v) thu được hai hợp chất 4 (5,0 mg) và 5 (4,0 mg).

Aristolactam AII (1): bột vô định hình, màu vàng, tan trong dung môi acetone.

Goniopedalin (2): bột vô định hình, màu vàng, tan trong dung môi acetone.

Piperolactam C (3): bột vô định hình, màu vàng, tan trong dung môi methanol.

10-Amino-3,6-dihydroxy-2,4-dimethoxyphenanthrene-1-carboxylic acid (4): bột vô định hình, màu vàng, tan trong dung môi methanol.

Noraristolodione (5): bột vô định hình, màu vàng nâu, tan trong dung môi methanol.

Các dữ liệu phổ H-NMR và C-NMR được trình bày trong Table 1 và Table 2.

Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO; 37 C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.

Thử độc tế bào: 200 mL dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 10 tế bào/mL vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM cho các dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, KB. Mẫu thử được pha loãng sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 256 mg/mL và các nồng độ pha loãng thấp hơn. Ủ 37 C, 5% CO trong 3 ngày.

Đối chứng dương gồm 200 mL dung dịch tế bào 3x10 tế bào/mL. Đối chứng âm gồm 200 mL môi trường nuôi cấy. Ellipticine (Sigma) được sử dụng làm hợp chất đối chứng dương. Sau 3 ngày nuôi cấy; ủ tiếp với MTT 0,2mg/mL ở 37 C trong 4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 mL DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.

Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) được tính toán dựa trên số liệu đo mật độ quang học OD trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau:

a: OD mẫu thử

b: OD control

Giá trị IC được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính Table curve.9, 10

Hợp chất 1

Aristolactam AII (1) thu được có dạng bột vô định hình, màu vàng. Phổ ESI-MS cho mũi ion phân tử giả với m/z 264,25 [M-H] tương ứng với công thức phân tử CHNO (giá trị tính toán lý thuyết là 264,07). Phổ H-NMR (Table 1) cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với một proton -NH [δ 10,78 (s)], một nhóm hydroxyl liên kết với vòng thơm [δ 10,29 (s, OH-3)], một nhóm methoxy [δ 4,02 (s, 4-OCH)] và sáu proton thơm, trong đó, có hai proton thơm cho hai tín hiệu mũi đơn [δ 7,09 (s, H-9) và 7,62 (s, H-2)], bốn proton thơm còn lại ghép spin với nhau của vòng benzene 1,2 nhị hoán [δ 9,11 (dd; 7,8; 1,2 Hz; H-5); 7,94 (dd; 7,8; 1,2 Hz; H-8); 7,55 (m, H-6/H-7)]. Phổ C-NMR (Table 2) và phổ HSQC cho thấy sự hiện diện của 16 carbon gồm một tín hiệu carbon carbonyl lactame tại δ 168,4; một tín hiệu của carbon nhóm methoxy tại δ 59,5; sáu carbon methine thơm [δ 113,4 (C-2); 126,8 (C-5); 127,3 (C-6); 125,3 (C-7); 128,9 (C-8); 103,9 (C-9)], hai carbon thơm tứ cấp gắn oxygen [δ 152,2 (C-3); 148,8 (C-4)] và sáu carbon thơm tứ cấp [δ 121,8 (C-1); 120,3 (C-4a); 126,0 (C-4b); 135,3 (C-8a); 134,8 (C-10); 122,3 (C-10a)]. Phổ HMBC cho thấy tương quan giữa proton H-2 với C-1, C-3, C-4, C-10a, C-11, giữa N-H với C-1, C-10, C-10a, C-11; giữa H-9 với C-4b, C-8, C-8a, C-10, C-10a và giữa H-5 với C-4a, C-4b, C-6, C-8a giúp xác định hợp chất 1 là một aristolactame mang nhóm thế -OH tại C-3 và -OCH tại C-4. So sánh với dữ liệu phổ NMR và MS với tài liệu tham khảo11, hợp chất 1 được xác định là aristolactam AII.

Hợp chất 2

Goniopedalin (2) là hợp chất dạng bột vô định hình, màu vàng. Phổ ESI-MS cho mũi ion phân tử giả m/z 318,11 [M+Na] (tính tóan lý thuyết cho CHNONa, 318,07). IR (ATR) v3460; 3167; 2977; 1688; 1652; 1457; 1348; 1257; 1060 cm. So sánh dữ liệu phổ NMR (Table 1 và Table 2) của hợp chất 2 với 1 cho thấy có sự tương đồng. Các tín hiệu cộng hưởng trên phổ 1D và 2D-NMR cho thấy sự hiện diện của một nhóm -NH, bốn proton methine thơm của một vòng benzene 1,2 nhị hoán, vòng C, trên khung sườn aristolactame (H-5, H-6, H-7, H-8); một tín hiệu mũi đơn của proton H-9. Ngoài các điểm tương đồng nêu trên, phổ NMR của hợp chất 2 còn có thêm hai tín hiệu mũi đơn của nhóm hai nhóm methoxy [δ4,03 (s, 4-OCH) và 4,36 (s, 2-OCH)], một tín hiệu mũi đơn của nhóm hydroxyl [δ 9,50 (s, 3-OH)]. Phổ HMBC cho thấy tương quan giữa proton nhóm hydroxyl với C-2, C-3, C-4 giúp xác định hợp chất 2 là một aristolactame mang nhóm thế -OH tại C-3 và hai nhóm methoxy gắn với C-2 và C-4. So sánh với dữ liệu phổ NMR và MS với tài liệu tham khảo12 hợp chất 2 được xác định là goniopedalin. Hợp chất này được nhóm tác giả Sunil K. Talapatra báo cáo có trong cây Goniothalamus sesquipedalis12.

Hợp chất 3

Piperolactam C (3) là hợp chất dạng bột vô định hình, màu vàng. Phổ ESI-MS cho mũi ion phân tử giả m/z 310,11 [M+H] (tính toán lý thuyết cho CHNO, 310,11). IR (ATR) v3357 2929; 2853; 1684; 1650; 1453; 1374; 1265; 1069 cm. Dữ liệu phổ NMR của 3 có sự tương đồng với 1 và 2 như phổ H-NMR (Table 1) cũng cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với một nhóm -NH, bốn proton methine thơm thuộc vòng C trên khung sườn aristolactame (H-5, H-6, H-7, H-8), một tín hiệu mũi đơn của proton H-9. Khi so sánh với 2, hợpchất 3 có ba nhóm methoxy trên vòng A của khung aristolactame [δ 4,12 (s, 4-OCH), 3,92 (s, 3-OCH), và 4,39 (s, 2-OCH]. Từ những dữ liệu trên, hợp chất 3 được xác định là piperolactame C 13.

Hợp chất 4

10-Amino-3,6-dihydroxy-2,4-dimethoxyphenanthrene-1-carboxylic acid (4) có dạng bột vô định hình, màu vàng. Phổ ESI-MS cho mũi ion phân tử giảm/z 312,10 [M+H] (tính toán lý thuyết cho CHNO, 312,09). IR (ATR) v3364; 2977; 2885; 1726; 1647; 1606; 1468; 1377; 1226; 1068 cm. So sánh dữ liệu phổ NMR (Table 1 và Table 2) với hợp chất 2 và 4 cho các tín hiệu cộng hưởng tương đồng, gồm một tín hiệu mũi đơn, ứng với proton -NH [δ 10,70 (s)], hai tín hiệu mũi đơn của hai nhóm methoxy [δ 4,00 (s, 4-OCH) và 4,32 (s, 2-OCH)], một mũi đơn của nhóm hydroxyl [δ 9,42 (s, 3-OH)]. Ngoài ra, ba tín hiệu cộng hưởng theo hệ thống ghép spin ABX được đề nghị cho ba proton thuộc vòng C của khung aristolactame tại [δ 8,51 (d; 2,4 Hz; H-5), 7,04 (dd; 8,4; 2,4 Hz; H-7), 7,74 (d; 9,0 Hz; H-8)], một tín hiệu mũi đơn của proton cô lập [δ 7,06 (s, H-9)]. Phổ C-NMR (Table 2) và phổ HSQC cho thấy sự hiện diện của 17 carbon gồm hai tín hiệu của carbon methoxy [δ 59,7 (4-OCH); 62,4 (2-OCH)], một tín hiệu carbon carbonyl lactame tại δ 166,6; năm carbon methine thơm [δ 110,7 (C-5); 116,5 (C-7); 129,9 (C-8); 104,3 (C-9)], bốn carbon thơm tứ cấp gắn oxygen [δ 148,5 (C-2); 143,5 (C-3); 149,8 (C-4) và 155,1 (C-6)] và sáu carbon thơm tứ cấp [δ 109,5 (C-1); 115,4 (C-4a); 126,7 (C-4b); 127,2 (C-8a); 132,0 (C-10); 121,8 (C-10a)]. Các tương quan HMBC (Figure 2) giúp xác định hợp chất 4 là một aristolactame mang nhóm thế -OCH tại C-2 và C-4. So sánh dữ liệu phổ với tài liệu tham khảo14 hợp chất 4 được xác định là 10-amino-3,6-dihydroxy-2,4-dimethoxyphenanthrene-1-carboxylic acid.

Hợp chất 5

Noraristolodione (5) có dạng bột bột vô định hình, màu vàng nâu. Phổ ESI-MS cho mũi ion phân tử giả m/z 294,09 [M+H] (tính toán lý thuyết cho CHNO, 294,08). IR (ATR) v3389; 2975; 2852; 1719; 1644; 1455; 1378; 1217; 1050 cm. So sánh phổ H-NMR (Table 1) của 5 với chất 1 nhận thấy có một số điểm tương đồng, gồm có các tín hiệu cộng hưởng ứng với một proton -NH [δ 12,0 (s)], một nhóm methoxy [δ 4,04 (s, 4-OCH)] và sáu proton thơm, trong đó, có hai proton thơm cô lập cho hai tín hiệu mũi đơn [δ 7,50 (s, H-9) và 8,08 (s, H-2)], bốn proton thơm liền kề, theo hệ thống spin ABCX [δ 9,40 (m, H-5); 7,91 (m, H-8); 7,64 (m, H-6/H-7)]. Phổ C-NMR (Table 2) và phổ HSQC cho thấy sự hiện diện của 17 carbon gồm hai tín hiệu carbon carbonyl liền kề [δ 177,4 (C-11); 156,2 (C-12)], một tín hiệu của carbon methoxy [δ 60,1], sáu carbon methine thơm [δ 117,5 (C-2); 127,6 (C-5); 128,4 (C-6); 127,3 (C-7); 128,8 (C-8); 112,7 (C-9)], hai carbon thơm tứ cấp gắn oxygen [δ 151,6 (C-3); 153,4 (C-4)] và sáu carbon thơm tứ cấp [δ 124,4 (C-1); 125,0 (C-4a); 126,4 (C-4b); 132,8 (C-8a); 130,4 (C-10); 117,6 (C-10a)]. Tương quan HMBC giữa H-2 với C-3, C-4, C-10a, C-11 giúp xác định hợp chất 5 là một dioxoaporphine mang nhóm thế -OH tại C-3 và -OCH tại C-4. So sánh dữ liệu phổ H-NMR15 và C-NMR13, hợp chất 5 được đề nghị là noraristolodione.

Kết quả thử nghiệm hoạt tínhgây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư ở người

Năm hợp chất alkaloid cô lập từ cao ethyl acetate của thân cây Dủ dẻ trâu được khảo sát hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư ở người, bao gồm tế bào ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (Hep-G2) và ung thư vú (MCF-7) bằng phương pháp MTT (Table 3). Trong đó, bốn hợp chất thuộc khung aristolactame đều cho hoạt tính trung bình trên dòng tế bào KB và Hep-G2, riêng hợp chất 5 không có hoạt tính. Đối với dòng tế bào MCF-7, hợp chất 2 và hợp chất 5 đều cho giá trị IC trong khoảng 80 mg/mL. Như vậy, trong năm alkaloid, hợp chất 2 cho hoạt tính trên cả ba dòng tế bào thử nghiệm.