MỞ ĐẦU

Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh về rối loạn chuyển hóa mãn tính của tuyến tụy, đặc trưng bởi mức đường huyết tăng cao với rối loạn chuyển hóa carbohydrate, chất béo và protein. Bệnh có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng ảnh hưởng đến các cơ quan chính trong cơ thể như mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu, cuối cùng có thể dẫn đến tử vong.1 Một trong những phương pháp điều trị bệnh (chủ yếu là ĐTĐ loại 2) hiệu quả hiện nay là sử dụng thuốc ức chế quá trình phân hủy carbohydrate trong thức ăn thành đường để giảm thiểu sự tăng cao đường huyết thông qua việc ức chế a-glucosidase.2α-Glucosidase thuộc nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân được tìm thấy trong biểu mô của ruột non.3 Enzyme này xúc tác quá trình cắt đứt liên kết 1,4-α-D-glucoside khỏi chất nền để tạo thành α-D-glucose. Bằng cách ức chế α-glucosidase, quá trình thủy phân các oligosaccharide giảm dẫn tới sự trì hoãn tốc độ hấp thu glucose vào máu. Điều này giúp giảm sự gia tăng glucose trong máu sau bữa ăn và tránh các biến chứng đái tháo đường về sau.4 Việc tìm kiếm các hoạt chất ức chế a-glucosidase từ tự nhiên được quan tâm lớn, đặc biệt là nhóm hợp chất flavonoid có hoạt tính ức chế a-glucosidase rất mạnh, mạnh hơn hoạt chất acarbose – là thuốc điều trị bệnh ĐTĐ hiện nay.5, 6 Nghiên cứu trước đây cho thấy lá Trứng cá (Muntingia calabura L.) chứa hàm lượng flavonoid cao,7, 8, 9, 10 và chiết xuất từ loài này có khả năng điều trị bệnh đái tháo đường rất hiệu quả.11, 12 Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu tìm hiểu về thành phần hoạt chất có khả năng ức chế a-glucosidase còn rất hạn chế.

Cây Trứng cá có tên khoa học là Muntingia calabura L., thuộc họ Côm, còn có thên khác là Mật sâm.13 Đây là loài duy nhất trong chi Muntingia và được trồng phổ biến ở những vùng nhiệt đới, ở Ấn Độ và Đông Nam Á như Malaysia, Indonesia, Philippine và Việt Nam.14 Trong y học cổ truyền một số nước trên thế giới, lá Trứng cá được dùng để điều trị các bệnh loét dạ dày, ĐTĐ, giảm sưng tuyến tiền liệt và giảm đau đầu.14, 15 Một số nghiên cứu cao ethanol lá Trứng cá an toàn với liều lên tới 5000 mg/kg,16 và có nhiều hoạt tính sinh học nổi bật như kháng oxy hoá, kháng viêm, chống lại hội chứng hô hấp cấp tính nặng (SARS-CoV-2) và gây độc một số tế bào ung thư như ung thư đại tràng (P-388 và HT-29), ung thư tuyến giáp vú (MCF-7) và ung thư máu (HL-60).8, 9, 10, 17 Tại Việt Nam, ba hợp chất flavonoid gồm kaempferol, tilirosid, kaempferol 3-O-(6"-O-galloyl)-β-D-glucopyranosid đã được phân lập cùng với các nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và kháng oxy hóa của chúng.18, 19 Nghiên cứu này định hướng phân lập các hợp chất flavonoid từ lá Trứng cá (M. calabura) và đánh giá khả năng điều trị hoạt tính ức chế α-glucosidase của chúng.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Chiết xuất và phân lập

Từ 3,0 kg mẫu lá Trứng cá khô, tiến hành cắt nhỏ và chiết Soxhlet lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexane, ethyl acetate, methanol. Các dịch trích được cô quay dưới áp suất kém thu hồi dung môi thu được các cao thô n-hexane (143,8 g), ethyl acetate (139,1 g) và methanol (286,0 g). Cao EtOAc được tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi giải ly là n-hexane–acetone (0–100% acetone) thu được 13 cao phân đoạn lần lượt là A (15,7 g), B (9,2 g), C (1,4 g), D (3,0 g), E (447,5 mg), F (2,5 g), G (2,8 g), H (9,7 g), I (7,2 g), J (3,2 g), K (2,7 g), L (30,2 g), M (17,9 g). Tiến hành kỹ thuật sắc ký lớp mỏng kết hợp khả năng hiện hình bằng thuốc thử HSO 20% cho thấy phân đoạn C và E tách tốt và có xuất hiện vết màu vàng đặc trưng của hợp chất flavonoid nên được chọn để khảo sát thành phần hóa học. Phân đoạn C tiến hành sắc ký cột hấp phụ trên silica gel pha thường với hệ dung môi giải ly n-hexane–CHCl (0–100% CHCl) thu được 7 phân đoạn gồm C1 (219,9 mg), C2 (28,9 mg), C3 (48,8 mg), C4 (322,6 mg), C5 (527,4 mg), C6 (206,8 mg), C7 (191,2 mg). Từ phân đoạn C5 (527,4 mg) tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi giải ly n-hexane–CHCl (0–80% CHCl) thu được hợp chất 2 (280,3 mg). Phân đoạn C4 tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi giải ly n-hexane–EtOAc (0–80% EtOAc) và tiếp tục sắc ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi giải ly toluene–CHCl (5:5) thu được hợp chất 1. Phân đoạn C6 tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi giải ly n-hexane–acetone (0–80% acetone) nhiều lần thu được hợp chất 4 (22,4 mg). Phân đoạn E được tiến hành sắc ký cột hấp phụ trên silica gel pha thường với hệ dung mội giải ly n-hexane–EtOAc (0–80% EtOAc) thu được 5 phân đoạn gồm E1 (59,2 mg), E2 (116,6 mg), E3 (52,9 mg), E4 (57,2 mg), E5 (106,1 mg). Tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường phân đoạn E2 với hệ dung môi giải ly n-hexane–EtOAc (0–60% EtOAc) và sau đó là -hexane–CHCl (0–60% EtOAc) thu được hợp chất 3 (3,4 mg) (Figure 1).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hợp chất 1 có dạng hình kim, màu vàng nhạt, tan tốt trong dung môi CHCl. Phổ H-NMR của hợp chất 1 ở vùng trường thấp xuất hiện tín hiệu của 7 proton thơm trong đó có 2 proton thơm ghép meta [δ6,49 (1H; d; J = 2,2 Hz; H-8)] và [δ 6,36 (1H; d; J = 2,2 Hz; H-6)]; 5 proton thơm ghép cặp với nhau [δ 8,20 (2H; dd; J = 1,4 và 8,7 Hz; H-2' và H-6')], [δ 7,53 (2H; m; H-3' và H-5')] và [δ 7,47 (1H; like-t;J = 7,3 Hz H-4']. Vậy hợp chất 1 có sự xuất hiện của 1 vòng benzene bốn nhóm thế và 1 vòng benzene một nhóm thế. Ngoài ra còn có sự xuất hiện tín hiệu của 1 nhóm hydroxyl kiềm nối [δ 12,70 (1H; s, 5-OH)] và 1 nhóm hydroxyl tự do [δ 6,69 (1H; s; 3-OH)]. Ở vùng trường cao có sự xuất hiện tín hiệu proton của một nhóm methoxyl [δ 3,87 (3H; s, 7-OCH)] (Table 1). Phổ C-NMR của hợp chất 1 xuất hiện tín hiệu của 16 carbon. Trong đó ở vùng trường thấp có 1 carbon carbonyl của ketone [δ 175,6; C-4]; 3 carbon thơm tứ cấp gắn oxygen [δ 166,2; C-7], [δ 161,1; C-5], [δ 157,2; C-9]; 2 carbon thơm tứ cấp [δ 130,9; C-1'] và [δ 104,2; C-10]; 7 carbon thơm tam cấp [δ 130,4; C-4'], [δ 128,8; C-3', C-5'], [δ 127,8; C-2', C-6'], [δ 98,2; C-6], [δ 92,4; C-8]; 2 carbon olefin gắn oxygen [δ 145,4; C-2] và [δ 136,8; C-3]. Ngoài ra, ở vùng trường cao xuất hiện tín hiệu 1 carbon methoxyl [δ 56,0; 7-OCH] (Table 2). Từ dữ liệu phổ H-NMR và C-NMR cho thấy hợp chất 1 có cấu trúc của một flavone với 1 nhóm methoxyl và 2 nhóm hydroxyl. Phân tích dữ liệu phổ HSQC và HMBC của hợp chất 1 cho thấy nhóm hydroxyl tự do được xác định tại vị trí C-3 thông qua tương quan HMBC của 3-OH với C-4, C-3 và C-2; nhóm hydroxyl kiềm nối được xác định tại vị trí C-5 thông qua tương quan HMBC của 5-OH với C-5, C-6 và C-10; nhóm methoxyl được xác định tại vị trí C-7 thông qua tương quan HMBC của 7-OCH với C-7 (Figure 2). Tiến hành tra cứu dữ liệu phổ của hợp chất 1 với tài liệu tham khảo hợp chất 3,5-dihydroxyl-7-methoxyflavone cho thấy có sự tương đồng21. Vì vậy, cấu trúc của hợp chất 1 được xác định là 3,5-dihydroxyl-7-methoxyflavone.

Hợp chất 2 có dạng hình kim, màu vàng nhạt, tan tốt trong dung môi acetone và CHCl. Phổ H-NMR của hợp chất 2 ở vùng trường thấp xuất hiện tín hiệu của 7 proton thơm gồm 2 proton thơm ghép meta [δ 6,67 (1H; d; J = 2,2 Hz; H-8)] và [δ 6,34 (1H; d; J = 2,2 Hz; H-6)]; 5 proton thơm ghép cặp theo với nhau [δ 8,10 (2H; m; H-2', H-6')] và [δ 7,58 (3H; m; H-3', H-4' và H-5')]. Điều này xác nhận hợp chất 2 có sự xuất hiện của 1 vòng benzene bốn nhóm thế và 1 vòng benzene một nhóm thế. Ngoài ra còn có sự xuất hiện tín hiệu của 1 nhóm hydroxyl kiềm nối [δ 12,63 (1H; s,5-OH)]. Ở vùng trường cao xuất hiện tín hiệu 6 proton của 2 nhóm methoxyl [δ 3,89 (3H; s; 3-OCH)] và [δ 3,92 (3H; s; 7-OCH)] (Table 1). Phổ C-NMR của hợp chất 2 xuất hiện tín hiệu của 17 carbon. Trong đó ở vùng trường thấp có 1 carbon carbonyl nhóm ketone [δ 178,9; C-4]; 3 carbon thơm tứ cấp gắn oxygen [δ 165,9; C-7], [δ 161,9; C-5], [δ 157,1; C-9]; 2 carbon thơm tứ cấp [δ 131,0; C-1'] và [δ 105,9; C-10]; 7 carbon thơm tam cấp [δ130,6; C-4'], [δ 128,6; C-3', C-5'], [δ 128,4; C-2', C-6'], [δ 97,8; C-6], [δ 92,1; C-8]; 2 carbon olefin gắn oxygen [δ 155,9; C-2] và [δ 139,5; C-3]. Ngoài ra ở vùng trường cao xuất hiện tín hiệu 2 carbon methoxyl [δ 59,7; 3-OCH] và [δ 55,6; 7-OCH] (Table 2). Phân tích dữ liệu phổ 1D-NMR của hợp chất 2 cho thấy cũng có cấu trúc của một flavone tương tự hợp chất 1 ở nhiều tín hiệu. Ngoại trừ có sự mất đi của 1 tín hiệu của proton nhóm hydroxyl (δ 6,69 ppm, 3-OH) ở hợp chất 1 và thay vào đó là sự xuất hiện thêm tín hiệu proton của 1 nhóm methoxyl (δ 3,89 ppm, 3-OCH và δ 59,7 ppm, 3-OCH). Tiến hành tra cứu dữ liệu phổ của hợp chất 2 với tài liệu tham khảo của hợp chất izalpinin cho thấy có sự tương đồng.22, 23 Vì vậy, cấu trúc của hợp chất 2 được xác định là izalpinin.

Hợp chất 3 có dạng hình kim, màu vàng nhạt, tan tốt trong dung môi CHCl Phổ H-NMR của hợp chất 3 ở vùng trường thấp xuất hiện tín hiệu của 5 proton thơm ghép cặp với nhau [δ 8,15 (2H; m; H-2', H-6')], [δ 7,53 (3H; m; H-3', H-4' và H-5')]; 1 proton thơm cô lập [δ 6,43 (1H; s; H-6)]. Điều này cho phép xác nhận hợp chất 3 có sự xuất hiện 1 vòng benzene năm nhóm thế và 1 vòng benzene một nhóm thế. Ngoài ra còn có sự xuất hiện tín hiệu proton của một hydroxyl kiềm nối [δ 12,42 (1H; s; 5-OH)]. Ở vùng trường cao có sự xuất hiện tín hiệu 9 proton của 3 nhóm methoxyl [δ 3,88 (3H; s; 3-OCH)], [δ 3,95 (3H; s; 7-OCH)] và [δ 3,91 (3H; s; 8-OCH)] (Table 1). Phổ C-NMR của hợp chất 3 xuất hiện tín hiệu của 18 carbon. Trong đó ở vùng trường thấp có 1 carbon carbonyl nhóm ketone [δ 179,3; C-4]; 4 carbon thơm tứ cấp gắn oxygen [δ 148,7; C-9], [δ 157,4; C-5], [δ 158,5; C-7], [δ 129,0; C-8]; 2 carbon thơm tứ cấp [δ 105,5; C-10] và [δ 130,7; C-1']; 6 carbon thơm tam cấp, [δ 95,5; C-6], [δ 128,4; C-2', C-6'], [δ 131,0; C-4'], [δ 128,7; C-3', C-5']; 2 carbon olefin [δ 155,8; C-2] và [δ 139,5; C-3]. Ngoài ra ở vùng trường cao xuất hiện tín hiệu 3 carbon methoxyl [δ 60,4; 3-OCH], [δ 61,7; 8-OCH] và [δ 56,4; 7-OCH] (Table 2). Phân tích dữ liệu phổ 1D-NMR của hợp chất 3 cũng có cấu trúc của một flavone tương tự hợp chất 2 ở nhiều tín hiệu. Ngoại trừ có sự mất đi một tín hiệu proton thơm (δ 6,67 ppm, H-8; δ92,1 ppm, C-8) ở hợp chất 2 và thay vào đó là sự xuất hiện thêm tín hiệu 3 proton của 1 nhóm methoxyl (δ 3,91 ppm, 8-OCHδ 61,7 ppm, 8-OCH và δ129,0 ppm, C-8) ở hợp chất 3. Tiến hành tra cứu dữ liệu phổ của hợp chất 3 với tài liệu tham khảo của hợp chất methylgnaphaliin cho thấy có sự tương đồng.24 Vì vậy, cấu trúc của hợp chất 3 được xác định là methylgnaphaliin.

Hợp chất 4 có dạng hình kim, màu vàng nhạt, tan tốt trong dung môi CHCl. Phổ H-NMR của hợp chất 4 ở vùng trường thấp xuất hiện tín hiệu của 7 proton thơm gồm 2 proton thơm ghép meta với nhau [δ 6,49 (1H; d; J = 2,3 Hz; H-8)] và [δ 6,36 (1H; d; J = 2,3 Hz; H-6)]; 5 proton thơm ghép cặp mới nhau [δ 7,87 (2H; m; H-2'; H-6')] và [δ 7,51 (3H; m; H-3'; H-4'; H-5')]. Điều này cho phép xác nhận hợp chất 4 có sự xuất hiện 1 vòng benzene bốn nhóm thế và 1 vòng benzene một nhóm thế. Ngoài ra còn có sự xuất hiện tín hiệu proton olefin cô lập [δ 6,65 (1H; s; H-3)]; 1 tín hiệu proton nhóm hydroxyl kiềm nối [δ 12,70 (1H; s; 5-OH)]. Ở vùng trường cao có sự xuất hiện tín hiệu proton của một nhóm methoxyl [δ 3,87 (3H; s; 7-OCH)] (Table 1). Phổ C-NMR của hợp chất 4 xuất hiện tín hiệu của 16 carbon. Trong đó ở vùng trường cao có 1 carbon carbonyl nhóm ketone [δ 182,6; C-4]; 3 carbon thơm tứ cấp gắn oxygen [δ 162,3; C-9], [δ 164,1; C-5], [δ 165,7; C-7]; 2 carbon thơm tứ cấp [δ 105,9; C-10] và [δ 131,9; C-1']; 7 carbon thơm tam cấp [δ 92,8; C-8], [δ 98,3; C-6], [δ 126,4; C-2', C-6'], [δ 131,4; C-4'], [δ 129,2; C-3', C-5']; 2 carbon olefin [δ 157,9; C-2] và [δ 105,8; C-3]. Ngoài ra ở vùng trường cao xuất hiện tín hiệu 1 carbon methoxyl [δ 55,9; 7-OCH]. Phân tích dữ liệu phổ 1D-NMR của hợp chất 4 cho thấy cũng có cấu trúc của một flavone tương tự hợp chất 1 ở nhiều tín hiệu. Ngoại trừ có sự mất đi 1 tín hiệu proton của nhóm hydroxyl tự do (δ 6,69 ppm, 3-OH và δ 136,8 ppm, C-3) ở hợp chất 1 và thay vào đó là sự xuất hiện thêm tín hiệu của proton olefin (δ 6,65 ppm, H-3 và δ 105,8 ppm, C-3) ở hợp chất 4. Tiến hành tra cứu dữ liệu phổ của hợp chất 4 và tài liệu tham khảo của hợp chất techtochrysin cho thấy có sự tương đồng.25 Vì vậy, cấu trúc của hợp chất 4 được xác định là techtochrysin.

Tiến hành thử hoạt tính ức chế α-glucosidase của 4 hợp chất phân lập được từ cao EtOAc của lá Trứng cá. Kết quả được cho thấy cả bốn hợp chất đều có hoạt tính phụ thuộc vào nồng độ thử nghiệm từ 250–50µg/mL, trong đó hợp chất 1, 2 có hoạt tính ức chế α-glucosidase mạnh với giá trị IC lần lượt là 61,4 và 156,1 µM, mạnh hơn chất đối chứng dương acarbose (IC = 214,5µM). Trong khi đó, hợp chất 4 có hoạt tính ức chế với giá trị IC 219,5 µM và hợp chất 3 có hoạt tính yếu (IC > 250 µM). Bên cạnh đó, hợp chất 4 có hoạt tính mạnh tương đương với chất đối chứng dương và hợp chất 3 có hoạt tính yếu tại các nồng độ thử nghiệm (Table 3). Nghiên cứu cho thấy sự hiện diện các nhóm thế hydroxyl hoặc methoxyl tại vị trí C-3 có khả năng làm tăng hoạt tính. Đặc biệt, nhóm hydroxyl tại vị trí C-3 làm tăng mạnh hoạt tính so với nhóm methoxyl (1 >> 2 > 3). Trong khi đó, sự xuất hiện nhóm methoxyl tại vị trí C-8 làm giảm mạnh hoạt tính (3 < 4) (Figure 3).

KẾT LUẬN

Bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp sắc ký bản mỏng trên cao EtOAc của lá Trứng cá, chúng tôi đã phân lập được 4 hợp chất flavone là izalpinin (1), 5-hydroxyl-3,7-dimethoxyflavone (2), techtochrysin (3) và methylgnaphaliin (4). Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định dựa vào phân tích phổ NMR kết hợp so sánh tài liệu tham khảo. Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy 4 hợp chất đều có khả năng ức chế α-glucosidase phụ thuộc nồng độ thử nghiệm. Trong đó hợp chất 1, 2 có hoạt tính ức chế α-glucosidase mạnh hơn chất đối chứng dương acarbose với giá trị IC lần lượt là 61,4 và 156,1 µM. Dựa vào thực nghiệm cho thấy sự có mặt nhóm thế hydroxyl hoặc methoxyl tại vị trí C-3 có khả năng làm tăng hoạt tính trong khi sự xuất hiện nhóm methoxyl tại vị trí C-8 làm giảm mạnh hoạt tính. Nghiên cứu này đã bổ sung thêm dữ liệu quốc gia về cây thuốc Việt Nam có khả năng điều trị bệnh đái tháo đường loại 2.

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu được tài trợ bởi Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh (ĐHQG-HCM) trong khuôn khổ Chương trình mã số NCM2020-18-01

DANH MỤC VIẾT TẮT

H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của H.

C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của C.

ĐTĐ: Đái tháo đường

HSQC: Phổ tương quan hạt nhân giữa C và H thông qua 1 liên kết.

HMBC: Phổ tương quan hạt nhân giữa C và H thông qua 2, 3 liên kết.

NP-G: 4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Các tác giả cam đoan không có bất kỳ xung đột lợi ích nào trong bài nghiên cứu này.

ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ

Đỗ Văn Nhật Trường và Lê Thành Phúc thu hái mẫu và điều chế cao chiết, Trần Thị Minh Tâm phân lâp các hợp chất, Lê Hữu Thọ giải cấu trúc các hợp chất và viết bản thảo bài báo, Nguyễn Xuân Hải, Nguyễn Anh Thy thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, Nguyễn Thị Thanh Mai phân bố cục và chỉnh sửa bản thảo chi tiết. Tất cả các tác giả đã đọc và chấp nhận bản thảo cuối cùng.