MỞ ĐẦU

Bệnh tai xanh, hay hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS), là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trong ngành chăn nuôi heo, gây rối loạn sinh sản ở heo nái và bệnh đường hô hấp ở heo con. Tác nhân gây bệnh là PRRSV, thuộc giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales1, có bộ gene là phân tử RNA sợi đơn, mạch dương, không phân đoạn, dài 15,3–15,5 kb, chứa 10 khung đọc mở gồm ORF1a, ORF1b, ORF2a, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5, ORF5a, ORF6 và ORF72. Trong đó, ORF5 mã hóa glycoprotein vỏ ngoài GP5 mang tính kháng nguyên cao3. Glycoprotein GP5 dài khoảng 200 amino acid, với trọng lượng phân tử là 24-26 kDa, chứa 3 vị trí glycosyl hóa N34, N44 và N514, 5, 3. GP5 gắn với màng bọc ngoài của PRRSV qua 3 domain xuyên màng tại các vị trí 62-83, 90-106 và 113-130, rất đa dạng về di truyền, có khả năng bám dính đa dạng trên bề mặt tế bào6. Sư siêu biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân làm gia tăng khả năng lây nhiễm và gây bệnh của PRRSV, khiến cho bệnh PRRS ngày càng phức tạp, làm giảm hiệu quả phòng bệnh của các vaccine hiện đang lưu hành5. Đồng thời, GP5 được xem là thành phần cảm ứng của kháng thể trung hòa, vì epitope trung hòa lớn nhất của PRRSV định vị tại trung tâm vùng domain ngoại bào của GP5 (từ amino acid 36 đến 52)7, 8. Do đó, GP5 còn được ứng dụng trong việc tạo kháng thể đơn dòng kháng PRRSV9. Mặc dù chưa được biết chính xác, nhưng nhiều công trình nghiên cứu cho thấy rằng đầu C của GP5 (từ amino acid 164 đến 200) có vai trò quan trọng trong truyền tải tín hiệu liên quan đến sự nhân lên của virus10, 11. Điều đặc biệt là motif GP5QWGRL/P tại đầu C của GP5 được bảo tồn ở tất cả chủng PRRSV thuộc dòng Bắc Mỹ12, 11. Nếu xảy ra đột biến amino acid tại vị trí này, sẽ ảnh hưởng đến độc lực của virus 10, 11.

Dựa vào sự khác biệt về tính di truyền, PRRSV được phân chia làm hai kiểu gene: kiểu gene Châu Âu, European genotype, đại diện là chủng Lelystad (LV), và kiểu gene Bắc Mỹ, Northern American genotype, đại diện là chủng virus ATCC-VR2332 5. PRRSV rất đa dạng về di truyền, độc lực, trình tự nucleotide và dễ xuất hiện những biến chủng; điều này gây khó khăn cho việc sản xuất vaccine phòng bệnh 5. Tại Việt Nam, PRRSV lưu hành trên đàn heo bao gồm cả hai kiểu gene Bắc Mỹ và Châu Âu. Từ năm 2012, PRRSV lây truyền trên heo ở các trại rất phức tạp, có thể được phân thành 3 kiểu nhiễm PRRSV: nhiễm 1 kiểu gene PRRSV Bắc Mỹ dòng Trung Quốc (65,22%), nhiễm 1 kiểu gene PRRSV Bắc Mỹ dòng cổ điển (32,60%), nhiễm đồng thời kiểu gene PRRSV Bắc Mỹ và kiểu gene Châu Âu (1,28%). Sự phức tạp của các kiểu gene PRRSV gây khó khăn không chỉ trong chẩn đoán mà cả trong việc áp dụng biện pháp tiêm phòng, lựa chọn vaccine đối với bệnh PRRS13. Do đó, việc chẩn đoán và phòng trị bệnh PRRS đến nay vẫn còn nhiều khó khăn nhất định.

Theo Cục thú y, các loại vaccine phòng bệnh PRRS đang được sử dụng phổ biến tại Việt Nam là: vaccine nhược độc Porcilis PRRS (chủng DV) của Intervet (Hà Lan), vaccine nhược độc Amervac PRRS (chủng VP046 BIS) của Hipra (Tây Ban Nha), vaccine nhược độc BSL-PS100 (chủng JKL 100) của Bestar (Singapore), vaccine nhược độc Ingelvac PRRS MLV (chủng ATCC VR2332) của Boehringer (Đức), vaccine vô hoạt (chủng NVDC-JXA1) của Chengdu (Trung Quốc), vaccine nhược độc (chủng JXA1-R) của CAHIC và của Đại Hoa Nông (Trung Quốc), vaccine phòng bệnh tai xanh của HANVET (Việt Nam)... Vaccine nhược độc đã được chứng minh có khả năng phòng bệnh cao hơn vaccine vô hoạt14.

Nhằm mục đích sản xuất vaccine sử dụng để tiêm phòng PRRS trên đàn heo tại Việt Nam, chúng tôi đã phân lập được chủng PRRSV cường độc BG8 từ heo bị bệnh, nuôi tiếp truyền nhiều đời trên tế bào MARC-145 để tạo ra chủng nhược độc và đã thu được chủng BG895 ở đời nuôi tiếp truyền thứ 95 không còn độc lực gây bệnh trên heo nhưng vẫn có khả năng gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể kháng PRRSV ổn định15. Chủng BG895 có bộ gene với kích thước 15.321 bp tương tự như chủng gốc BG8 nhưng mang 38 đột biến thay thế nucleotide làm thay đổi 14 amino acid. Đột biến nhiều nhất và quan trọng nhất xảy ra ở protein GP3 và GP5. Vị trí amino acid thay đổi trong các protein của PRRSV (từ chủng BG8 đến chủng BG895) có khả năng ảnh hưởng đến đặc điểm sinh học và tính sinh miễn dịch ở các chủng, đặc biệt là những thay đổi tạo thành arginine (R), cysteine (C) như YC/(GP5), QR/(GP5), tạo nên điểm cắt của protease giải phóng oligopeptide miễn dịch16, 17, 12, 15, 18, 11. Như vậy, chủng nhược độc BG895 tuy xuất hiện nhiều đột biến nhưng vẫn giữ nguyên tính sinh miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu trên heo đồng thời không còn khả năng gây bệnh, nên là chủng có tiềm năng được dùng để sản xuất vaccine phòng bệnh tai xanh tại Việt Nam.

Do glycoprotein GP5 được mã hóa bởi ORF5 có vai trò quan trọng trong miễn dịch đối với bệnh tai xanh, nếu một chủng PRRSV (thuộc kiểu gene Bắc Mỹ) được chọn làm kháng nguyên để sản xuất vaccine có trình tự ORF5 và GP5 khác biệt quá lớn so với trình tự tương ứng của các chủng lưu hành trong thực tế thì vaccine có thể bị giảm hoặc không còn khả năng bảo hộ. Bên cạnh việc khảo sát tính ổn định của kháng nguyên virus qua quá trình nuôi tiếp truyền, việc phân tích biến đổi di truyền trên ORF5, GP5 và mối quan hệ về trình tự tương ứng của các chủng trên thế giới, đặc biệt ở Việt Nam, là cần thiết nhằm góp phần tạo cơ sở khoa học cho hiệu quả phòng bệnh của chủng PRRSV dùng làm kháng nguyên vaccine. Trong bài báo này, chúng tôi phân tích các biến đổi nucleotide trên ORF5 và amino acid trên GP5 của chủng virus cường độc gốc BG81 qua quá trình tiếp truyền trên tế bào MARC-145 để thu nhận chủng nhược độc BG895 trong mối tương quan với các trình tự tương ứng của 5 chủng PRRSV gây bệnh khác được phân lập tại Việt Nam để xác định khả năng bảo hộ khi được chọn làm kháng nguyên vaccine. Cùng với những kết quả thu được từ công trình nghiên cứu của Bùi Anh Thy và cộng sự năm 202015, tính ổn định kháng nguyên GP5 của chủng BG895 qua 95 đời tiếp truyền trên tế bào cũng được kiểm chứng thêm thông qua việc phân tích trình tự amino acid và các đặc trưng amino acid đầu C của GP5, đồng thời xem xét mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự amino acid trên GP5 của chủng nhược độc BG895 so với các chủng PRRSV cường độc thực địa và các chủng nhược độc được sử dụng làm vaccine ở nước ta. Các kết quả này là cơ sở khoa học cần thiết trước khi tiến hành đánh giá tính an toàn và khả năng bảo hộ của chủng BG895 dùng làm kháng nguyên vaccine trên heo nuôi thực nghiệm và nuôi trong thực tế sản xuất.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

KẾT QUẢ

Thu nhận ORF5 bằng phản ứng PCR

Đoạn gene tương ứng với ORF5 của chủng PRRSV gốc BG81 và các chủng được nuôi tiếp truyền đến đời thứ 25 (BG825), 50 (BG850), 75 (BG875), 80 (BG880), 85 (BG885), 90 (BG890), 95 (BG895) và 100 (BG8100) được nhân bản bằng phản ứng PCR từ cDNA tương ứng (Figure 1). Tất cả các sản phẩm PCR được khuếch đại từ đoạn gene ORF5 của các lần tiếp truyền virus trên tế bào đều có kích thước 800 bp (Figure 1). Qua quá trình nuôi tiếp truyền phải chăng đã không xảy ra đột biến mất đoạn hay thêm đoạn trên vùng gene ORF5? Để biết chính xác, toàn bộ đoạn gene ORF5 của chủng BG81 và các chủng được nuôi tiếp truyền (BG825, BG850, BG875, BG880, BG885, BG890, BG895 và BG8100) đều được giải trình tự.

Đột biến thay đổi nucleotide trên ORF5 và amino acid trên GP5 trong quá trình nuôi tiếp truyền

Để nghiên cứu độ ổn định của kháng nguyên glycoprotein GP5 do gene ORF5 mã hoá, trình tự nucleotide và amino acid của chủng virus BG81 và ở các lần tiếp truyền khác nhau (BG825, BG850, BG875, BG880, BG885, BG890, BG895 và BG8100) được phân tích và so sánh với 5 chủng PRRSV được phân lập tại Việt Nam là TG34 (Tiền Giang, 2011), DN42 (Đồng Nai, 2009), HCM.CC3 (Hồ Chí Minh, 2010), CT.C1 (Cần Thơ, 2012), HUA/HP30 (Bắc Ninh, 2015) và 2 chủng nhược độc vaccine là JXA1-R (Trung Quốc) và HANVET1.VN (Việt Nam). Kết quả cho thấy độ dài trình tự nucleotide trên đoạn gene ORF5 của chủng virus gốc và các lần tiếp truyền đều là 603 bp, và chiều dài chuỗi amino acid của glycoprotein GP5 là 200 amino acid (Figure 2 và Figure 3). Các vị trí thay đổi nucleotide trên ORF5 và biến đổi amino acid trên GP5 được trình bày trong Table 3 và Table 4.

Chủng gốc BG81 qua quá trình tiếp truyền nhiều đời trên tế bào MARC-145 đã xảy ra đột biến điểm thay thế nucleotide tại các vị trí 144, 316, 317, 436, 587 (Figure 2 và Table 3). Sau 25 đời tiếp truyền tại vị trí 144 có sự thay đổi T > C, đột biến này được duy trì đến đời 95, nhưng đến đời 100 có sự hồi biến C > T. Tại vị trí 317 xảy ra đột biến A > G từ đời 25, được duy trì đến đời 100. Tại vị trí 587, từ đời 95 mới xảy ra đột biến A > G, được duy trì đến đời 100. Ở đời 100, ngoài 3 đột biến điểm tại 3 vị trí 144, 317 và 587, còn xảy ra thêm 2 đột biến nucleotide T > C ở vị trí 316 và C > T ở vị trí 436.

So sánh trình tự nucleotide trên ORF5 của chủng BG895 với trình tự tương ứng của 5 chủng cường độc được phân lập tại Việt Nam (Figure 2 và Table 3), đã ghi nhận được là: (i) So với chủng TG34 (Tiền Giang), có 5 sự sai khác tại các vị trí nucleotide lần lượt là 29, 144, 317, 495 và 587; (ii) So với chủng DN42 (Đồng Nai) có 6 sự sai khác ở các vị trí nucleotide lần lượt là 144, 189, 310, 317, 495 và 587; (iii) So với chủng HCM.CC3 (Hồ Chí Minh) có 16 sự sai khác ở các vị trí nucleotide lần lượt là 29, 71, 86, 104, 144, 172, 240, 279, 317, 378, 447, 471, 495, 519, 587 và 599; (iv) So với chủng CT.C1 (Cần Thơ) có 7 sự sai khác ở các vị trí nucleotide lần lượt là 144, 171, 246, 279, 317, 495 và 587; (v) So với chủng HUA/HP30 (Bắc Ninh) có 12 sự sai khác ở các vị trí nucleotide 44, 86, 101, 144, 240, 279, 317, 447, 471, 490, 495, và 587. Như vậy, so sánh trình tự nucleotide trên ORF5 của chủng BG895 với 5 chủng PRRSV cường độc, kết quả ghi nhận có 4 vị trí đột biến điểm xảy ra trên tất cả 5 chủng là 144 (C > T), 317 (G > A), 495 (C > T) và 587 (G > A); trong đó, có 2 vị trí đột biến sai nghĩa là 317 (G > A), và 587 (G > A), và 2 vị trí đột biến này cũng được tìm thấy trên chủng BG895 khi so với chủng gốc BG81.

So sánh trình tự nucleotide trên ORF5 của chủng BG895 với trình tự tương ứng của chủng HANVET1.VN, cũng đã ghi nhận được 14 sai khác ở các vị trí nucleotide lần lượt là 86, 97, 101, 135, 144, 177, 240, 279, 317, 447, 471, 490, 495 và 587. Trong khi đó, so với chủng JXA1-R (Trung Quốc) có 14 sự sai khác ở các vị trí nucleotide thứ 86, 101, 135, 144, 177, 240, 266, 279, 317, 447, 471, 490, 495 và 587. Trong số các vị trí biến đổi nucleotide trên ORF5 xảy ra trên cả 2 chủng với JXA1-R và HANVET1.VN khi so sánh với BG895, có 6 đột biến sai nghĩa xảy ra ở các vị trí 86 (C > T), 101 (G > A), 177 (A > T), 317 (G > A), 490 (G > A) và 587 (G > T), và 7 đột biến đồng nghĩa ở các vị trí 135 (A > G), 144 (C > T), 240 (A > G), 279 (A > G), 447 (A > G), 471 (A > G) và 495 (C > T).

Vị trí nucleotide thay đổi

BG81

BG825

BG850

BG875

BG880

BG885

BG890

BG895

BG8 100

TG34

JXA1-R

HANVET1.VN

DN42

HCM.CC3

CT.C1

HUA/HP30

29

G

G

G

G

G

G

G

G

G

A

G

G

G

A

G

G

44

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

C

71

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

G

A

A

86

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

T

T

C

T

C

T

97

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

G

A

A

A

A

101

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

A

A

G

G

G

A

104

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

G

A

A

135

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

G

G

A

A

A

A

144

T

T

C

C

C

C

C

C

T

T

T

T

T

T

T

T

171

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

G

A

172

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

G

C

C

177

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

T

T

A

A

A

A

189

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

G

A

A

A

240

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

G

G

A

G

A

G

246

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

T

C

C

C

266

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

G

A

A

A

A

A

279

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

G

G

A

G

G

G

310

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

A

G

G

G

316

T

T

T

T

T

T

T

T

C

T

T

T

T

T

T

T

317

A

G

G

G

G

G

G

G

G

A

A

A

A

A

A

A

378

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

A

G

G

436

C

C

C

C

C

C

C

C

T

C

C

C

C

C

C

C

447

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

G

G

A

G

A

G

471

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

G

G

A

G

A

G

490

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

A

A

G

G

G

A

495

C

C

C

C

C

C

C

C

C

T

T

T

T

T

T

T

519

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

C

G

G

587

A

A

A

A

A

A

A

G

G

A

T

T

A

A

A

A

599

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

C

T

T

Từ kết quả so sánh thành phần nucleotide, trình tự amino acid trên protein GP5 do gene ORF5 mã hóa cũng được so sánh (Figure 3 và Table 4). Chủng gốc BG81 qua quá trình tiếp truyền trên tế bào MARC-145 từ đời 25 đến đời 95 tại vị trí amino acid 106, tyrosine (Y) đã đột biến thành cysteine (C); đến đời 100, cysteine (C) tại vị trí 106 này biến đổi thành arginine (R); tại vị trí 196, đến đời 95, glutamine (Q) thay đổi thành arginine (R), duy trì đến đời 100.

So sánh trình tự amino acid trên GP5 của chủng BG895 với trình tự tương ứng của 5 chủng cường độc được phân lập tại Việt Nam (Figure 3 và Table 4) đã ghi nhận được như sau: (i) So với chủng TG34, có 3 sự sai khác ở các vị trí amino acid lần lượt là 10, 106 và 196; (ii) So với chủng DN42, có 3 sự sai khác ở các vị trí amino acid lần lượt là 104, 106 và 196; (iii) So với chủng HCM.CC3, có 7 sự sai khác ở các vị trí amino acid lần lượt là 10, 24, 29, 35, 106, 196 và 200; (iv) So với chủng CT.C1, có 2 sự sai khác ở các vị trí amino acid lần lượt là 106 và 196; (v) So với chủng HUA/HP30, có 6 sự sai khác ở các vị trí amino acid 15, 29, 34, 106, 164 và 196. Khi so sánh chủng BG895 với chủng HANVET1.VN, có 6 sai khác ở các vị trí amino acid 29, 34, 59, 106, 164 và 196; so với chủng JXA1-R có 7 sai khác ở các vị trí amino acid 29, 34, 59, 89, 106, 164 và 196.

Tóm lại, kết quả phân tích trình tự gene ORF5 cho thấy chủng BG81 có sự sai khác về trình tự nucleotide qua 95 đời tiếp truyền. Cụ thể ở chủng BG895 có 3 vị trí biến đổi nucleotide là T>C ở vị trí 144, A>G ở vị trí 317 và A>G ở vị trí 587, nhưng chỉ xảy ra 2 vị trí biến đổi amino acid Y106C và Q196R so với các chủng tiếp truyền trước và sau đời 95.

Vị trí amino acid thay đổi

BG81

BG825

BG850

BG875

BG880

BG885

BG890

BG895

BG8 100

TG34

JXA1-R

HANVET1.VN

DN42

HCM.CC3

CT.C1

HUA/HP30

10

C

C

C

C

C

C

C

C

C

Y

C

C

C

Y

C

C

15

L

L

L

L

L

L

L

L

L

L

L

L

L

L

L

P

24

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

C

Y

Y

29

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

V

V

A

V

A

V

34

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

N

N

S

S

S

N

35

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

S

N

N

59

K

K

K

K

K

K

K

K

K

K

N

N

K

K

K

K

89

D

D

D

D

D

D

D

D

D

D

G

D

D

D

D

D

104

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

R

G

G

G

106

Y

C

C

C

C

C

C

C

R

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

164

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

R

R

G

G

G

R

196

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

R

R

Q

L

L

Q

Q

Q

Q

200

L

L

L

L

L

L

L

L

L

L

L

L

L

P

L

L

Đặc điểm biến đổi đầu C của GP5 ở chủng nhược độc BG985

Để phân tích đặc điểm biến đổi đầu C của GP5 trong quá trình nuôi tiếp truyền tạo chủng nhược độc, chủng BG895 được so sánh với các chủng vaccine nhược độc thuộc kiểu gene Bắc Mỹ trên thế giới, bao gồm các chủng RespPRRS-MLVvac, Ingelvac ATP, CH-1R, JXA1-R, HuN4-F122, TJM và XHGD-P122 cũng được nhược độc hóa bằng phương pháp tiếp truyền nhiều đời trên tế bào từ các chủng cường độc gốc lần lượt là VR2332, JA142, CH-1a, JXA1, HuN4, TJ và XHGD 16, 25, 21, 17. Theo ghi nhận ở trên, chủng nhược độc BG895 có 2 đột biến amino acid ở đầu C của GP5: một đột biến Y106C xuất hiện sớm, trước đời 25 và một đột biến muộn Q196R ở đầu C của GP5 xuất hiện sau đời 90, duy trì từ đời 95 (BG895) đến đời 100 (BG8100) (Figure 4). Motif GP5QWGRLđột biến đã tạo nên motif mới là GP5RWGRL, và motif này cũng xuất hiện trong các chủng HuN4-F122, TJM và XHGD-P122 ở Trung Quốc16, 25, 17, 12.

Một số nghiên cứu chỉ ra rằng, ở đầu C của GP5, motif GP5QWGRL/P bảo tồn trong tất cả chủng PRRSV thuộc kiểu gene Bắc Mỹ được biết cho đến nay12, 11. Đột biến tạo nên ở motif GP5RWGRLtrong các chủng nhược độc/vaccine nói trên và kể cả chủng BG895, có ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch của protein này hay không là vấn đề cần xem xét cụ thể12. Mặc dù vậy, motif GP5RWGRLcó ở hầu hết các chủng vaccine PRRS nhược độc của Trung Quốc và Việt Nam chứng minh nguyên lí biến đổi amino acid vị trí 196 (Q196R) ở GP5 trong quá trình tiếp truyền các chủng PRRSV có độc lực cao (HP-PRRSV) này.

Cây phả hệ dựa trên trình tự amino acid của GP5 ở các chủng BG8 qua các đời nuôi tiếp truyền

Trình tự amino acid của GP5 (200 amino acid) của các chủng BG8 qua các đời nuôi tiếp truyền và trên 92 chủng PRRSV được dùng để phân tích phả hệ (Figure 5). Trên cây phả hệ tại Figure 5, tất cả 101 trình tự GP5 của 101 chủng được sắp xếp trong 2 nhánh là kiểu gene Bắc Mỹ (North American genotype) và kiểu gene châu Âu (European genotype). Kiểu gene Bắc Mỹ phân thành 4 dòng (lineage) chính, gồm: dòng 1-4, dòng 2, dòng 3 và dòng 5-9 và các phân dòng (sublineage) của chúng. Trong đó, các chủng PRRSV độc lực cao xuất hiện tại châu Á thuộc phân dòng 8.7 19 và các chủng PRRSV xuất hiện tại Âu Mỹ thuộc dòng 5, 7, 9 và phân dòng 8.9. Các chủng PRRSV cường độc (HP-PRRSV) được phân lập sau những năm 2005-2006 được nhóm lại bên trong dòng 8.719. Chủng gốc BG81 và các chủng qua các đời nuôi tiếp truyền trong nghiên cứu này (BG825, BG850, BG875, BG880, BG885, BG890, BG895 và BG8100) đều thuộc kiểu gene Bắc Mỹ và nằm chung trong phân dòng 8.7 cùng với các chủng PRRSV cường độc phân lập ở Việt Nam từ năm 2009 đến nay và các chủng Trung Quốc phân lập sau 2007.

Ngoài ra, cây phả hệ cho thấy nhóm các chủng vaccine thương mại RespPRRS-MLVvac, MLVvac-RespPRRSRepro, BCL PS 100 đều tập trung trong dòng 5, Prime Pac, SPvac nằm trong dòng 7, còn IngelVacATP thuộc phân dòng 8.9, hoàn toàn riêng biệt với phân dòng 8.7 xuất hiện tại châu Á, ngoại trừ 2 vaccine JXA1-R của (Trung Quốc) và HANVET1.VN (Việt Nam) nằm trong phân dòng 8.7. Điều này nhắc nhở mối tương quan amino acid ở GP5 giữa vaccine có nguồn gốc Bắc Mỹ (vaccine cổ điển) phản ánh mức độ sai lệch nhất định trong sự tương quan kháng nguyên-miễn dịch và đòi hỏi cần có vaccine có nguồn gốc chủng từ phân dòng 8.7 đáp ứng sự phù hợp miễn dịch phòng chống các chủng mới xuất hiện (HP-PRRSV) đang lưu hành 19.

THẢO LUẬN

Bộ gene PRRSV gồm 10 khung đọc mở gồm ORF1a, ORF1b, ORF2a, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5, ORF5a, ORF6 và ORF7. Trong đó, GP5 do ORF5 mã hóa, là một trong những protein cấu trúc màng, có tính kháng nguyên đa dạng nhất, đóng vai trò quan trọng trong sự xâm nhiễm virus vào tế bào chủ và có domain chứa các epitope tạo kháng thể trung hòa nên nó liên quan chặt chẽ hoặc rất quan trọng đối với khả năng trung hòa virus của hệ thống miễn dịch của vật chủ2, 8. Do vậy, GP5 được chọn làm kháng nguyên để nghiên cứu các motif peptide/protein, chẳng hạn peptide tín hiệu, vùng xuyên màng, vùng kháng nguyên và vị trí glycosyl hóa… có vai trò trong hoạt động sống, nhân bản và sự tương tác của PRRSV với vật chủ. Sự biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân làm gia tăng khả năng lây nhiễm và gây bệnh của PRRSV, khiến cho bệnh tai xanh ngày càng phức tạp, do làm giảm hiệu quả phòng bệnh của các vaccine hiện đang lưu hành5. Đầu C của GP5 (từ amino acid 164 đến 200) chứa motif GP5QWGRL/P được bảo tồn ở hầu hết các chủng PRRSV thuộc kiểu gene Bắc Mỹ 12, 11. Nếu xảy ra đột biến amino acid tại vị trí này, sẽ ảnh hưởng đến độc lực của virus10, 11.

Chủng PRRSV BG895 trong nghiên cứu này được tạo ra bằng cách nuôi tiếp truyền chủng gốc BG81 nhiều đời trên tế bào MARC-145 nhằm thu nhận được chủng nhược độc làm chủng gốc để thử nghiệm sản xuất vaccine PRRS tiêm phòng trên đàn heo tại Việt Nam. Chủng BG895 đã được chứng minh không còn độc lực gây bệnh trên heo nhưng vẫn có khả năng gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể kháng PRRSV ổn định 15. Chủng BG895 có bộ gene kích thước 15.321 bp tương tự như chủng gốc BG81 nhưng mang 38 đột biến thay thế nucleotide làm thay đổi 14 amino acid. Đột biến nhiều nhất và quan trọng nhất xảy ra ở protein GP3 và GP5. Như vậy, chủng nhược độc BG895 tuy xuất hiện một số đột biến làm giảm độc lực virus nhưng vẫn giữ nguyên tính sinh miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu trên heo. Do đó, chủng BG895 có tiềm năng được dùng để làm kháng nguyên vaccine. Trong bài báo này, dựa trên phân tích trình tự GP5, chúng tôi đánh giá tính ổn định kháng nguyên GP5 và mối quan hệ di truyền của chủng BG895 so với chủng gốc BG81 và các chủng PRRSV đang lưu hành tại Việt Nam làm cơ sở cho việc dùng chủng BG895 làm kháng nguyên trong vaccine thử nghiệm để đánh giá tính an toàn và hiệu quả phòng bệnh PRRS.

Kết quả phân tích trình tự amino acid GP5 và xác lập cây phả hệ cho thấy GP5 của chủng nhược độc BG895 vẫn ổn định qua các lần tiếp truyền và thuộc kiểu gene Bắc Mỹ nằm trong phân dòng 8.7 cùng với các chủng PRRSV đang lưu hành tại Việt Nam, có mức độ tương đồng cao hơn so với các chủng vaccine JXA1-R và HANVET1.VN. Từ chủng BG81 đến chủng BG895, có 3 vị trí biến đổi nucleotide, T>C ở vị trí 144, A>G ở vị trí 317, và A>G ở vị trí 587 dẫn đến thay đổi 2 vị trí amino acid Y106C, Q196R. Hai vị trí biến đổi amino acid này không liên quan đến vùng domain ngoại bào, nơi được xem là vùng chứa epitope trung hòa chính trên GP5 (nằm tại vị trí amino acid 36-52)8, nên không ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch của virus. Theo kết quả về những biến đổi amino acid trên GP5, khảo sát cho thấy đột biến Y106C bắt đầu sau đời 25 được duy trì đến đời 95, còn đột biến Q196R xuất hiện muộn sau đời 90, duy trì từ đời 95 đến đời 100 nên phải chăng đến đời 95, chủng BG895 mất khả năng gây độc lực nhưng vẫn giữ tính sinh miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu. Tuy nhiên, nếu tiếp truyền quá 100 đời, thì có thể có khả năng xảy ra thêm đột biến amino acid trên GP5, thí dụ như đột biến C106R được ghi nhận ở BG8100. Những đột biến này có ảnh hưởng đến chức năng sinh học của virus hay không, cần có thêm các khảo sát. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng một số đột biến amino acid có thể có mức độ ảnh hưởng nhất định đến chức năng của protein kháng nguyên, thí dụ như các thay đổi tạo thành arginine (R), cysteine (C) dẫn đến sự hình thành điểm cắt của protease tạo ra các oligopeptide miễn dịch; hoặc sự tạo thành asparagine (N), aspartic acid (D), lysine (K) có vai trò trong sự gấp cuộn của protein dẫn đến sự tăng cường hoặc giảm bớt chức năng sinh học của protein kháng nguyên 19, 12, 26. Đột biến Q196R tại đầu C của GP5 cũng xảy ra ở các chủng vaccine nhược độc HuN4-F112, TJM, XH-GDP122, tạo nên motif mới GP5RWGRL16, 25, 17, 12. Motif này bắt đầu xuất hiện trên GP5 từ đời 95 (BG895) được duy trì đến đời 100 (BG8100). Điều này gợi ra rằng, đột biến trên GP5 có ảnh hưởng đến độc lực của chủng gốc, nhưng không làm thay đổi tính sinh miễn dịch tạo kháng thể; đồng thời, không nên tiếp truyền quá đời 95 vì việc tiếp truyền quá mức cần thiết có thể ảnh hưởng đến biến đổi phản chiều trong hệ gene của chủng PRRSV như nghiên cứu của Yu và cộng sự 26, cụ thể trong nghiên cứu này, ở lần tiếp truyền 100, tại vị trí amino acid 106 đã xảy ra thêm 1 đột biến C106R.

KẾT LUẬN

Nhằm mục đích tạo ra chủng virus nhược độc dùng làm kháng nguyên vaccine phòng bệnh tai xanh ở heo, việc nuôi cấy tiếp truyền chủng PRRSV cường độc gốc BG81 trên tế bào MARC-145 đã được thực hiện và thu được chủng nhược độc BG895 có tiềm năng sử dụng làm kháng nguyên vaccine. Dựa trên phân tích trình tự ORF5 và GP5, tính ổn định của kháng nguyên đã được phân tích và khảo sát mối quan hệ tương đồng của chủng BG895 so với chủng gốc BG81 và một số chủng PRRSV gây bệnh khác được phân lập tại Việt Nam. Kết quả phân tích cho thấy qua quá trình tiếp truyền từ chủng gốc BG81 đến chủng BG895 đã xảy ra đột biến điểm thay thế nucleotide tại các vị trí 144, 317, 587 trên ORF5 và 2 đột biến thay đổi amino acid ở đầu C của GP5 là Y106C xuất hiện sớm trước đời 25 và Q196R xuất hiện muộn sau đời 90. Khi so sánh với BG81, chủng BG895 có 99,5% tương đồng về trình tự nuleotide trên ORF5, và 99% tương đồng về trình tự amino acid trên GP5. GP5 của chủng BG895 có độ tương đồng 97,3-99,1% về trình tự nucleotide và 96-99% về trình tự amino acid so với 5 chủng PRRSV cường độc khác đã được phân lập tại Việt Nam. Tại đầu C của GP5 ghi nhận đột biến Q196R góp phần hình thành motif GP5RWGRLlà motif thường xuất hiện trên kháng nguyên GP5 của các chủng PRRSV nhược độc thuộc kiểu gene Bắc Mỹ. Phân tích cây phả hệ dựa trên trình tự amino acid của GP5 cho thấy các chủng BG81-BG895 thuộc kiểu gene Bắc Mỹ, nằm trong phân dòng 8.7 thường xuất hiện ở châu Á và chủng BG895 có 96-99,5% tương đồng với các chủng đang lưu hành Việt Nam. Các kết quả này xác nhận tính ổn định kháng nguyên của chủng BG895 và mối quan hệ chặt chẽ với các chủng PRRSV tại Việt Nam. Trên cơ sở này, trong các nghiên cứu tiếp theo, chủng BG895 sẽ được sử dụng làm kháng nguyên tạo vaccine để đánh giá tính an toàn và khả năng bảo hộ đối với PRRSV gây bệnh tai xanh trên heo nuôi thực nghiệm và nuôi trong thực tế sản xuất.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

aa: amino acid (A, alanine; R, arginine; N, asparagine; D, aspartic acid; C, cysteine; E, glutamic acid; Q, glutamine; G, glycine; H, histidine; I, isoleucine; L, leucine; K, lysine; M, methionine; F, phenylalanine; P, proline; S, serine; T, threonine; W, tryptophan; Y, tyrosine; V, valine).

bp: base pair

cDNA: complement Deoxyribonucleic acid

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate

DMSO: Dimethyl sulfoxide

GP: Glycoprotein

HP-PRRSV: Highly pathogenic - Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

kb: kilobase

kDa: kiloDalton

M: Membrane

N: Nucleocapsid

nt: nucleotide (A: Adenine, C: Cytosine, G: Guanine, T: Thymine)

ORF: Open reading frame

PCR: Polymerase chain reaction

PRRS: Porcine reproductive and respiratory syndrome

PRRSV: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

RNA: Ribonucleic acid.

RNase: Ribonuclease

RT – PCR: Reverse transcription – polymerase chain reaction

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Các tác giả đồng ý không có bất kỳ xung đột lợi ích nào liên quan đến các kết quả đã công bố.

ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ

Bùi Anh Thy thực hiện các thí nghiệm, thu thập, xử lý các dữ liệu và viết bản thảo.

Trần Xuân Hạnh đóng vai trò định hướng, lên kế hoạch nghiên cứu.

Trần Linh Thước góp phần thảo luận các kết quả nghiên cứu, hoàn chỉnh bản thảo.